[發明專利]基于病毒樣顆粒的A型口蹄疫病毒抗體檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201811492102.4
• 申請日: 2018-12-07
• 公開（公告）號: CN109799343A
• 公開（公告）日: 2019-05-24
• 發明（設計）人: 郭慧琛;孫世琪;白滿元;張韻;張禹;茹嘉喜;楊志元;王蕊;何繼軍;羅建勛
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543;G01N33/535
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張晉

本發明公開一種采用A型口蹄疫病毒樣顆粒（VLPs）制備的檢測試劑盒及制備方法。本發明的A型口蹄疫病毒抗體競爭ELISA檢測試劑盒內包括有：包被A型口蹄疫病毒樣顆粒的酶標板，HRP標記的兔抗、含有吐溫和磷酸鹽緩沖液的樣品稀釋液和洗滌液、TMB底物、陽性對照血清、陰性對照血清、以及濃硫酸與水混合的終止液。本發明相對現有技術具有更好的安全性、良好的免疫原性，以及更高的靈敏度及特異性。

技術領域

本發明涉及一種抗體檢測試劑盒及其制備方法，確切講本發明涉及一種采用A型口蹄疫病毒樣顆粒（VLPs）制備的檢測試劑盒及制備方法。

背景技術

口蹄疫（Foot-and-mouth disease, FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdisease virus, FMDV）引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病，其主要感染豬、牛、羊等偶蹄動物。FMDV有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3、Asia I 7個血清型，而這7個血清型間幾乎沒有交叉免疫保護反應。由于FMD傳播速度極快，血清型和基因型不斷的變化，且血清型之間不存在交叉保護性，給口蹄疫防控帶來了極大的挑戰。近年來，A、O型在中國部分地區以交替流行的態勢出現，且其疫情復雜、涉及面廣、破壞性強。我國新疆的阿克蘇地區及韓國等地在2009-2013年間相繼出現A型口蹄疫疫情；2013年3月廣東茂名某豬場出現了A型口蹄疫臨床發病病例，之后便在我國的某些省份及周邊國家俄羅斯、哈薩克斯坦相繼發生疫情，造成了重大的經濟損失。目前預防口蹄疫最有效的方法是接種疫苗，主要根據地區性流行毒株的亞型，進行大規模地調查了解有關流行毒株的抗原漂移、轉移等特性，選擇匹配的疫苗株來免疫接種動物，為防控動物口蹄疫疾病，需要有效的方法來精確快速地檢測動物感染的病原和疫苗免疫水平，因此，一種穩定可靠的檢測方法顯得尤為重要。

目前用于檢測FMDV抗體的ELISA方法大多是以滅活病毒、重組病毒、單個蛋白或多肽等作為抗原，以完整病毒粒子作為抗原雖具有許多優點，但卻存在安全風險，而單個蛋白或多肽的免疫原性相對較差，影響其使用的效果。

現階段大多數競爭ELISA試劑盒都是將HRP標記在抗競爭性抗體的抗體上，這就導致它們的實驗步驟多，用時長，多在1 h以上，參見中國專利申請CN105445457A、CN107064501A等公開的內容。

發明內容

本發明提供一種可克服現有技術不足，用于檢測A型口蹄疫病毒抗體的競爭ELISA檢測試劑盒及其制備方法。

本發明的A型口蹄疫病毒抗體競爭ELISA檢測試劑盒內包括有：包被A型口蹄疫病毒樣顆粒的酶標板，HRP標記的兔抗、含有吐溫和磷酸鹽緩沖液的樣品稀釋液和洗滌液、TMB底物、陽性對照血清、陰性對照血清、以及濃硫酸與水混合的終止液。

本發明的A型口蹄疫病毒抗體競爭ELISA檢測試劑盒制備方法是將HRP直接標記在跟被檢抗體同時作用的競爭性抗體上，其制備過程包括：用A型口蹄疫病毒樣顆粒免疫兔，免疫結束后，從兔心臟采血，分離血清并用Protein A親和層析法分離純化得到IgG，采用過碘酸鈉方法將HRP標記到IgG上。

優選地，本發明的A型口蹄疫病毒抗體競爭ELISA檢測試劑盒制備方法中，其內酶標板包被的A型口蹄疫病毒樣顆粒是由A型口蹄疫病毒的結構蛋白VP0、VP1和VP3組裝而成，其中VP0、VP1和VP3的序列分別為SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和 SEQ ID No.3。

優選地，本發明的A型口蹄疫病毒抗體競爭ELISA檢測試劑盒制備方法中，所用的酶標板制備是：用0.05%（pH=9.6）的碳酸鹽包被緩沖液將A型FMDV VLPs稀釋為1.0μɡ/mL，以每孔100 μL的量加入酶標板，4℃包被過夜，洗滌液洗板3次；加入以酶標板穩定劑配制的含1%BSA封閉液，每孔120 μL，37℃恒溫箱封閉1 h，洗板3次，干燥，真空包裝。