[發(fā)明專利]一種新型埃博霉素生物合成基因P3啟動子及其制備方法和應(yīng)用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201811486406.X | 申請日： | 2018-12-06 |
| 公開（公告）號： | CN109679950B | 公開（公告）日： | 2022-02-25 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 葉偉;章衛(wèi)民;劉桃妹;李浩華;李賽妮;黃自磊;朱牧孜;許麗瓊 | 申請（專利權(quán)）人： | 廣東省微生物研究所（廣東省微生物分析檢測中心） |
| 主分類號： | C12N15/113 | 分類號： | C12N15/113;C12N15/10;C12N15/70 |
| 代理公司： | 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001 | 代理人： | 劉明星;朱聰聰 |
| 地址： | 510070 廣東省廣*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 新型 霉素 生物 合成 基因 p3 啟動子 及其 制備 方法 應(yīng)用 | ||
本發(fā)明公開了一種新型埃博霉素生物合成基基因P3啟動子及其制備方法和應(yīng)用。P3啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明首次采用設(shè)計簡并引物的方法擴增So ce M4埃博霉素生物合成基因的啟動子，并對其進行克隆及啟動子元件分析，并采用熒光素酶報告基因載體驗證所得埃博霉素生物合成基因啟動子的功能。所得新型埃博霉素生物合成基因簇啟動子可為纖維堆囊菌埃博霉素生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控及埃博霉素生物合成基因簇的異源表達奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)，促進埃博霉素產(chǎn)量的提高，促進埃博霉素在生物醫(yī)藥方面的廣泛應(yīng)用。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種新型埃博霉素生物合成基基因P3啟動子及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
纖維堆囊菌是一種能產(chǎn)生豐富的具有生物學(xué)活性次級代謝產(chǎn)物的粘細菌，埃博霉素是由纖維堆囊菌產(chǎn)生的具有廣譜高效抗腫瘤活性的十六元大環(huán)內(nèi)酯類化合物。埃博霉素由于其較好的水溶性、較低的副作用、更廣譜的抗腫瘤活性及對耐藥性腫瘤細胞良好的抗腫瘤活性，成為最有望取代紫杉醇的化合物。埃博霉素衍生物已經(jīng)批準用于臨床治療晚期乳腺癌，但由于埃博霉素產(chǎn)量較低，價格較昂貴，因此限制了其廣泛應(yīng)用。埃博霉素的生物合成基因簇已經(jīng)鑒定，且不同纖維堆囊菌的埃博霉素生物合成基因簇存在一定差異。目前關(guān)于纖維堆囊菌埃博霉素生物合成基因啟動子的報道較少。
發(fā)明內(nèi)容：
本發(fā)明的第一個目的是提供一種新型埃博霉素生物合成基基因P3啟動子。
本實驗室從土壤中分離得到了一株產(chǎn)埃博霉素纖維堆囊菌，采用設(shè)計簡并引物對其埃博霉素生物合成基因啟動子進行了克隆，并采用熒光素酶報告基因?qū)υ搯幼拥墓δ苓M行了驗證，為纖維堆囊菌埃博霉素的生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其基因簇的異源表達奠定了基礎(chǔ)，從而為埃博霉素產(chǎn)量的提高奠定了分子生物學(xué)基礎(chǔ)，促進埃博霉素在生物醫(yī)藥行業(yè)的廣泛應(yīng)用。
本發(fā)明的新型埃博霉素生物合成基基因P3啟動子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本發(fā)明的第二個目的是提供上述新型埃博霉素生物合成基基因P3啟動子在控制基因表達中的應(yīng)用。所述的基因表達包括轉(zhuǎn)錄的起始時間和表達的程度。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種纖維堆囊菌埃博霉素生物合成基因P3啟動子的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
所述的P3啟動子由人工合成或根據(jù)上述P3啟動子的序列設(shè)計引物，以纖維堆囊菌So ce M4、纖維堆囊菌So ce 90或So ce 2161的基因組為模板進行擴增，將擴增產(chǎn)物進行切膠回收，連接至pMD18-T載體，氨芐平板進行篩選，所得陽性克隆即含有P3啟動子。
本發(fā)明首次采用設(shè)計簡并引物的方法擴增So ce M4埃博霉素生物合成基因的啟動子，并對其進行克隆及啟動子元件分析，并采用熒光素酶報告基因載體驗證所得埃博霉素生物合成基因啟動子的功能。所得新型埃博霉素生物合成基因簇啟動子可為纖維堆囊菌埃博霉素生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控及埃博霉素生物合成基因簇的異源表達奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)，促進埃博霉素產(chǎn)量的提高，促進埃博霉素在生物醫(yī)藥方面的廣泛應(yīng)用。
本發(fā)明的纖維堆囊菌So ce M4保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC)，其保藏編號為：GIM 1.777，該菌株在本專利的申請日之前是對外銷售的。
附圖說明：
圖1為P3及P5片段的PCR擴增圖；
圖2為P3啟動子插入pBL3-Basic的雙酶切驗證圖；
圖3為熒光定量分析不同啟動子插入pGL3-Basic重組菌上清的熒光強度對比分析圖；
具體實施方式：
以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
實施例1：啟動子P3的克隆及分析：
一、啟動子序列的克隆
該專利技術(shù)資料僅供研究查看技術(shù)是否侵權(quán)等信息，商用須獲得專利權(quán)人授權(quán)。該專利全部權(quán)利屬于廣東省微生物研究所（廣東省微生物分析檢測中心），未經(jīng)廣東省微生物研究所（廣東省微生物分析檢測中心）許可，擅自商用是侵權(quán)行為。如果您想購買此專利、獲得商業(yè)授權(quán)和技術(shù)合作，請聯(lián)系【客服】
本文鏈接：http://www.szxzyx.cn/pat/books/201811486406.X/2.html，轉(zhuǎn)載請聲明來源鉆瓜專利網(wǎng)。
