[發明專利]一種FTL敲低的人前列腺癌細胞株

有效

• 申請號: 201811475820.0
• 申請日: 2018-12-04
• 公開（公告）號: CN110257337B
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發明（設計）人: 張曼;趙慧君;蔡佳
• 申請（專利權）人: 張曼
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12R1/91
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供一種慢病毒感染人前列腺癌細胞株（PC?3）敲除內源性基因，并成功建立穩篩細胞株。具體是利用FTL?shRNA慢病毒感染PC?3細胞株沉默FTL（鐵蛋白輕鏈）表達，成功建立FTL敲低PC?3細胞株。本發明通過研究證實FTL敲低PC?3細胞株可穩定沉默FTL表達并傳代。與陰性對照相比，敲低FTL后的PC?3細胞株中FTL蛋白表達水平顯著下降，細胞增殖能力和遷移能力顯著增強。

技術領域

本發明涉及慢病毒感染人前列腺癌細胞株（PC-3）敲除內源性基因，并成功建立穩篩細胞株。具體是利用FTL- shRNA慢病毒感染PC-3細胞株沉默FTL（鐵蛋白輕鏈）表達，成功建立FTL敲低PC-3細胞株。

背景技術

前列腺癌在西方國家男性高發的惡性腫瘤中，其死亡率高，居癌癥死亡率的第二位，僅次于肺癌，近年來，隨著人們生活方式的改變、人口的老齡化以及診斷水平的不斷提升，我國前列腺癌的發病率呈明顯上升趨勢，成為嚴重危害我國男性身體健康的重要疾病之一。自20世紀90年代起，前列腺癌的實驗研究在我國受到重視并迅速開展，然而人們對雄激素非依賴階段前列腺癌及晚期前列腺癌的相關發病機制知之甚少，目前尚無有效的治療方法，當前的研究仍然處于摸索階段，還需要通過大量的體內外實驗進行深入的探索。

鐵蛋白主要存在于肝臟、脾臟和大腦的錐體外側束的細胞核中，是鐵在體內較為穩定的貯存形式。由功能不同的亞型：鐵蛋白輕鏈（FTL）組成和鐵蛋白重鏈（FTH）。FTL缺乏酶活性，即L亞型，相對分子質量為19000；FTH具有酶活性，即H亞型，相對分子質量 21000，可以將二價鐵氧化成三價鐵。鐵蛋白參與多種疾病過程，目前大量臨床和流行病學研究發現，體內鐵蛋白儲存量增高可能與罹患肝癌、肺癌、結腸癌、食管癌、胃腸道腫瘤、胰腺癌、乳腺癌有關，特別是當肝癌AFP測定值較低時，可測定鐵蛋白濃度作為補充，以提高診斷效率。在多數腫瘤組織中，鐵蛋白水平高于正常組織。

腫瘤基因治療領域的新技術—RNA干擾（RNA interference，RNAi），是由雙鏈RNA引發的轉錄后基因沉默現象（post-transcriptional gene silencing，PTGS），因其抑制效果確切、高特異性、高效性等特點而被廣泛應用。以病毒載體形式表達的短發夾RNA（shorthairpin RNA，shRNA），通常是利用RNA聚合酶Ⅲ啟動子（人或鼠U6或人H1啟動子）轉錄下游反向重復DNA序列，形成小發夾結構，被Dicer等酶識別而切割成小干擾RNA（smallinterfering RNA，siRNA），進而穩定而特異地沉默基因，是發揮RNAi的有效方式。RNAi是研究基因功能、基因治療的重要工具,目前已應用于惡性腫瘤、病毒感染性疾病基因治療的研究。與腺病毒、逆轉錄病毒等其它病毒載體系統相比，慢病毒(Lentivirus)不僅能轉導分裂細胞，還能轉導非分裂期細胞，將外源性基因整合到靶細胞的基因組當中，從而實現對靶細胞中的目的基因穩定、持續的沉默。選用慢病毒做為載體系統來研究RNAi對細胞中基因的干擾過程具有巨大的潛力和明顯的優勢。

PC-3細胞株是從前列腺癌骨轉移腫瘤中分離出來的細胞株，分化程度低，為雄激素非依賴性前列腺癌細胞，不含有內源性的雄激素受體，具有中等強度的轉移潛能，被廣泛于雄激素抵抗型的前列腺癌的研究。

近年來針對鐵蛋白研究較多的腫瘤主要為卵巢癌、乳腺癌及肝癌，對前列腺癌中的研究尚且不足。因此，我們利用RNAi技術用FTL重組表達載體感染PC-3細胞建立FTL敲低的PC-3細胞模型，為研究FTL在前列腺癌早期診斷和基因治療中應用提供了有力的實驗材料。

發明內容