[發(fā)明專利]一種IL-12蛋白突變體及其制備方法和應(yīng)用、NK細(xì)胞培養(yǎng)體系和培養(yǎng)NK細(xì)胞的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201811475730.1
• 申請日: 2018-12-04
• 公開（公告）號: CN109517052A
• 公開（公告）日: 2019-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李陶;吳爽;陳玉華
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇祿億生生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/54
• 分類號: C07K14/54;C12N15/24;C12N5/0783
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 張春水;唐京橋

本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種IL?12蛋白突變體及其制備方法和應(yīng)用、NK細(xì)胞培養(yǎng)體系和培養(yǎng)NK細(xì)胞的方法。本發(fā)明提供了一種IL?12蛋白突變體，IL?12蛋白突變體由突變型IL?12基因所編碼；所述突變型IL?12基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。結(jié)果表明IL?12蛋白突變體能夠促進(jìn)NK細(xì)胞的活化和增殖，增加NK細(xì)胞表型的比例，提高NK細(xì)胞的純度，能夠在短時間內(nèi)使得NK細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量增加，并能增強NK細(xì)胞對腫瘤的殺傷能力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種IL-12蛋白突變體及其制備方法和應(yīng)用、NK細(xì)胞培養(yǎng)體系和培養(yǎng)NK細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞是一類大顆粒淋巴細(xì)胞，主要分布于外周各淋巴器官及血液循環(huán)系統(tǒng)，可產(chǎn)生大量參與免疫檢測和免疫應(yīng)答的干擾素γ(Interferon-γ，IFN-γ)和穿孔素，是免疫系統(tǒng)的重要組成成分。NK細(xì)胞不表達(dá)特異性的抗原識別受體，無需抗原的預(yù)先刺激與活化即可發(fā)揮細(xì)胞毒效應(yīng)，尤其是對多種腫瘤細(xì)胞有快速殺傷和溶解的作用，是抗腫瘤的第一道防線。因其毒副作用小，已廣泛應(yīng)用于臨床的相關(guān)治療。

NK細(xì)胞占外周血淋巴細(xì)胞的5％～10％，與外周血相比，臍帶血中NK細(xì)胞含量較多，可達(dá)20％，但想要達(dá)到臨床治療的效果仍需要對NK細(xì)胞進(jìn)行體外大量擴(kuò)增。目前NK細(xì)胞培養(yǎng)有兩種常見的培養(yǎng)方法，第一種是采用基因工程改造過的細(xì)胞作為滋養(yǎng)層進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，第二種是采用純因子刺激單個核細(xì)胞，向NK細(xì)胞方向誘導(dǎo)、擴(kuò)增培養(yǎng)。第一種培養(yǎng)方法得到的NK細(xì)胞純度高，陽性率可達(dá)到90％以上，但該培養(yǎng)方法在培養(yǎng)過程中選用的滋養(yǎng)層細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞，存在安全隱患。第二種培養(yǎng)方法所使用的細(xì)胞因子是體內(nèi)環(huán)境原本就存在的，培養(yǎng)過程相當(dāng)于模擬體內(nèi)環(huán)境，能夠促進(jìn)NK細(xì)胞的激活及大量增殖，安全性高，但培養(yǎng)得到的NK細(xì)胞純度較低，NK細(xì)胞的表型陽性率僅達(dá)到60％～70％左右。采用多種細(xì)胞因子可促進(jìn)NK細(xì)胞的擴(kuò)增，單獨作用效果不顯著，聯(lián)合作用效果可顯著增加。目前，體外擴(kuò)增高純度NK細(xì)胞體系中常用的是IL-2、IL-15和IL-12的細(xì)胞因子組合，但經(jīng)過一段時間后擴(kuò)增NK細(xì)胞的倍數(shù)以及得到的NK細(xì)胞純度和殺傷活性不夠理想，不能完全滿足實際應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種IL-12蛋白突變體及其制備方法和應(yīng)用、NK細(xì)胞培養(yǎng)體系和培養(yǎng)NK細(xì)胞的方法，用于解決目前采用細(xì)胞因子組合進(jìn)行NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增，經(jīng)過一段時間后僅能使NK細(xì)胞擴(kuò)增幾倍或幾十倍，并且得到的NK細(xì)胞純度和殺傷活性不夠理想，不能完全滿足實際應(yīng)用的問題。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

一種IL-12蛋白突變體，IL-12蛋白突變體由突變型IL-12基因所編碼；

所述突變型IL-12基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

白細(xì)胞介素是一組由多種類型細(xì)胞分泌的，能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化和免疫活性的細(xì)胞因子，與NK細(xì)胞關(guān)系密切，具有直接參與NK細(xì)胞的調(diào)控或通過影響其它免疫細(xì)胞間接調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的功能。已有許多文獻(xiàn)報道IL-2、IL-15、干細(xì)胞集落刺激因子等對促進(jìn)NK細(xì)胞的分化成熟、活化、增殖及細(xì)胞毒活性有重要作用。IL-12與IL-2具有某種相似的功能特性，它們均能增強細(xì)胞的殺傷活性，介導(dǎo)IFN的產(chǎn)生及正向調(diào)節(jié)NK細(xì)胞及粘附分子。其中IL-12更具有應(yīng)用于臨床治療腫瘤的潛力。IL-12是由p35、p40兩個亞基共同組成的異源二聚體，兩個亞基單獨存在時沒有生物學(xué)活性，只有結(jié)合成異二聚體后才具有生物學(xué)活性。NK細(xì)胞表面有其受體(IL-12R)，能夠刺激NK細(xì)胞的活性，又稱細(xì)胞毒性細(xì)胞成熟因子或NK細(xì)胞刺激因子。IL-12能上調(diào)NK細(xì)胞NKG2D和穿孔素的表達(dá)以提高NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，并誘導(dǎo)不成熟樹突狀細(xì)胞分化為成熟DC，后者可以與NK細(xì)胞一起協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。IL-12還可直接上調(diào)NK細(xì)胞表面CD2、CD11a和CD56等黏附分子表達(dá)，從而增強NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。