[發(fā)明專利]哺乳動物細胞表達載體及其構建方法與應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811470247.4
• 申請日: 2018-11-28
• 公開（公告）號: CN111218476B
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發(fā)明（設計）人: 張桂濤;李志坤;王勇剛;蘭萬軍;龍婷;林如新;陳靜山
• 申請（專利權）人: 東莞太力生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 廣州華進聯(lián)合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 崔明思

1.一種哺乳動物細胞表達載體，其特征在于，所述哺乳動物細胞表達載體包括有：篩選基因表達框和目的基因表達框；

所述篩選基因表達框包括篩選基因啟動子和篩選基因序列；

所述篩選基因啟動子為SV40核心啟動子；所述篩選基因序列的5’端連接有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的富含A/T的序列，且不含有Kozak序列；

所述SV40核心啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述篩選基因為zeocin抗性基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根據(jù)權利要求1所述的哺乳動物細胞表達載體，其特征在于，所述篩選基因表達框的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根據(jù)權利要求1所述的哺乳動物細胞表達載體，其特征在于，所述哺乳動物細胞表達載體的骨架部分取自真核表達載體pMCS。

4.一種哺乳動物細胞表達載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)構建篩選基因表達框：所述篩選基因啟動子為SV40核心啟動子；所述篩選基因序列的5’端連接有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的富含A/T的序列，且不含有Kozak序列；所述SV40核心啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述篩選基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；

(2)合成表達載體中除篩選基因表達框外的其余部分，所述除篩選基因表達框外的其余部分中包含有目的基因表達框以及復制子；

(3)將所述篩選基因表達框與表達載體中除篩選基因表達框外的其余部分連接，即得哺乳動物細胞表達載體。

5.根據(jù)權利要求4所述的哺乳動物細胞表達載體的構建方法，其特征在于，步驟(2)所述表達載體中除篩選基因表達框外的其余部分由以下方法制備得到：

以載體pMCS為模板，pMinus-1-V-F和pMinus-1-V-R為引物進行PCR擴增，即得；其中，所述pMinus-1-V-F核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述pMinus-1-V-R的核苷酸序列如SEQID NO.8所示。

6.根據(jù)權利要求4所述的哺乳動物細胞表達載體的構建方法，其特征在于，步驟(1)中所述構建篩選基因表達框由以下方法制備得到：

以核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的篩選基因表達框架序列pzeocin為模板，以pMinus-1-F-F和pMinus-1-F-R為引物，PCR擴增，即得；其中，所述pMinus-1-F-F核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，pMinus-1-F-R核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。