[發(fā)明專利]甘薯SPVD病毒重組雙CP融合蛋白、由其制備的多克隆抗體、其制備方法及其應用

在審

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• 申請日: 2018-11-30
• 公開（公告）號: CN109503720A
• 公開（公告）日: 2019-03-22
• 發(fā)明（設計）人: 隋炯明;郭寶太;王晶珊;李恩廣;王霞;鄭春花;趙春梅;喬利仙
• 申請（專利權）人: 青島農業(yè)大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;C07K16/10;G01N33/569
• 代理公司: 北京天奇智新知識產權代理有限公司 11340
• 代理人: 賈文健

1.一種甘薯SPVD病毒重組雙CP融合蛋白，其特征在于：是由甘薯褪綠矮化病毒和甘薯羽狀斑駁病毒CP基因的融合片段構建到重組表達載體，轉化表達菌株，誘導表達得到。

2.根據權利要求1所述甘薯SPVD病毒重組雙CP融合蛋白，其特征在于：所述甘薯褪綠矮化病毒和甘薯羽狀斑駁病毒CP基因的融合片段的核酸序列如SEQ ID No:1所示。

3.根據權利要求1或2所述甘薯SPVD病毒重組雙CP融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白序列如SEQ ID No:2所示。

4.根據權利要求3所述甘薯SPVD病毒重組雙CP融合蛋白的制備方法，其特征在于：步驟如下：

(1)重組表達載體的構建：在甘薯褪綠矮化病毒和甘薯羽狀斑駁病毒CP基因的融合片段兩端分別加上NdeⅠ和HindⅢ的酶切接頭，酶切后，連接到原核表達載體pET22b，得到重組表達載體；

(2)轉化表達菌株：將重組表達載體轉化Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞；

(3)誘導表達：挑取(2)中陽性克隆，誘導表達融合蛋白；

(4)融合蛋白純化：采用鎳離子親和層析純化融合蛋白。

5.根據權利要求4所述甘薯SPVD病毒重組雙CP融合蛋白的制備方法，其特征在于：所述誘導表達條件為：IPTG添加終濃度為0.5mM，誘導溫度20℃，轉速220rpm，誘導過夜。

6.權利要求4或5所述方法制備的甘薯SPVD病毒重組雙CP融合蛋白的應用。

7.一種甘薯SPVD病毒重組雙CP多克隆抗體的制備方法，其特征在于：采用權利要求4或5所述方法制備的甘薯SPVD病毒重組雙CP融合蛋白免疫兔，獲得的抗血清即為甘薯SPVD病毒重組雙CP多克隆抗體。

8.權利要求7方法制備的甘薯SPVD病毒重組雙CP多克隆抗體。

9.權利要求8所述多克隆抗體在制備檢測甘薯SPVD病毒的試劑中的應用。

10.一種檢測甘薯SPVD病毒方法，其特征在于：步驟如下：

(1)取待測甘薯葉，用液氮研磨破碎后，按10mL/g加入病毒提取緩沖液并進一步研磨，4℃、12000r離心5min后取上清液；

(2)每反應孔加150μL(1)中的上清液，4℃包被過夜后洗滌；加200μL 3％的BSA進行封閉；

(3)每孔加150μL稀釋的權利要求7的多克隆抗體、150μL的酶標二抗稀釋液及150μL的底物液，最后加100μL的1.5M NaOH終止反應；用酶標儀在450nm波長下測定OD值。