[發明專利]一種用于定量檢測乙型肝炎病毒的試劑盒

在審

• 申請號: 201811453520.2
• 申請日: 2018-11-30
• 公開（公告）號: CN109371170A
• 公開（公告）日: 2019-02-22
• 發明（設計）人: 董志強;王明璐;蕭錦華;楊呈勇
• 申請（專利權）人: 廣東騰飛基因科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6858;C12R1/93
• 代理公司: 北京一格知識產權代理事務所(普通合伙) 11316
• 代理人: 趙永偉

本發明涉及本一種用于檢測乙型肝炎病毒核酸的熒光定量PCR試劑盒，包括用于檢測HBV病毒的S基因、C基因。檢測的特異性強，靈敏度高，最低檢測限為10IU/mL，用時短，從標本送檢到得出結果可在2小時以內完成。

技術領域

本發明涉及乙型肝炎病毒檢測領域，更特別地，涉及一種用于定量檢測乙型肝炎病毒的試劑盒。

背景技術

乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,HBV)是引起乙型肝炎(簡稱乙肝)的病原體，是急慢性肝炎、肝硬化、肝癌的重要致病因子，也是全世界最嚴重的公共衛生問題之一。全球約20億人被證明有乙肝感染，3.5億人為慢性感染者。我國屬于世界上HBV感染高發區，全國約1.3億人是HBV攜帶者，慢性肝炎患者2300萬，每年乙肝的發病率在6000萬人次以上。在中國、東南亞和非洲等國家和地區，有約50％的肝硬化和70-90％的肝癌，是由慢性HBV感染引起，而感染了HBV變異體的HBV攜帶者有7-30％。

乙肝病毒血清標志物(HBV-M)檢測是診斷乙型肝炎最常用的指標,目前臨床最常用的“兩對半”指的是HBsAg、HBeAg、HBcAb、HBsAb、HBeAb，主要反映人體對乙肝病毒(HBV)感染的免疫狀態，但不能直接反映HBV在患者體內的復制情況，更不能作為判斷患者是否具有傳染性的直接證據。

檢測乙肝病毒DNA是判斷乙肝病毒有無復制的“金指標”，HBV DNA的檢測是衡量乙肝傳染性的最精確的指標，HBV DNA陽性即反映有完整的病毒顆粒的復制，是判斷患者具有傳染性的最直接和最可靠的指標，同時，HBV DNA還可作為判定HBV藥物療效的一個極有意義的臨床指標。如果檢測值大于1000或者1.0e+003拷貝/ML，說明乙肝病毒DNA呈陽性，提示HBV復制和有傳染性。HBV-DNA越高表示病毒復制越厲害，傳染性強。這對于乙肝治療過程中的監測，治療效果的判斷，治療方案的制定都有著重要的意義。

PCR法包括有巢式聚合酶鏈式反應(nested PCR，nPCR)、多重PCR(multiplex PCR，mPCR)、競爭性PCR(competitive PCR，cPCR)等多種方法。但都為定性檢測方法，不能直接定量。目前臨床常用的實時熒光定量PCR技術是把核酸擴增、雜交、光譜分析和實時檢測結合在一起，借助于熒光信號檢測PCR產物，可解決傳統PCR技術不能定量和擴增產物污染的問題，但此方法不能檢測病毒的全部基因型，定量不準確，并且試劑用量大，操作時間久。

發明內容

微流控芯片技術是把生物樣品的反應和檢測等基本操作單元集成到一塊小型芯片尚，基于微流控管道的方式，方便地控制PCR檢測的全過程。芯片上有進/出樣品的加載孔、樣品流通的通道、及反應腔室三部分。每個反應腔室是一個獨立的PCR體系，具有試劑消耗小，反應速度塊、檢測靈活、操作便捷、無污染、全自動化等優點。

本試劑盒的探針兩端都標有熒光發光基團，在探針完整時，兩基團在空間結構上距離相互靠近，5′端報告基團發出的熒光因為熒光共振能量轉移(FRET)而被3′端淬滅基團淬滅，所以體系中沒有熒光信號的變化。而一旦探針與模板特異性的結合，其結合位點在兩條引物之間，隨著引物的延伸，Taq DNA聚合酶在鏈延伸過程中遇到與模板相結合的探針，其5′-3′外切酶活性就會將探針切斷，熒光報告基團遠離熒光淬滅基團，這樣就破壞了兩熒光基團之間的FRET，報告基團所釋放出來的熒光就可以被內置在定量檢測儀內的熒光計檢測到。PCR每經過一個循環，熒光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數增長的過程，熒光信號的強弱就代表了模板DNA的拷貝數的多少。因此本發明不僅可用于簡單的定性檢測，亦可用做樣本具體含量的定量檢測。

HBV病毒中的S基因、C基因是保守型較高的序列區域，因此本試劑盒針對HBV病毒的S基因、C基因，設計特異序列的探針，可特異性探測HBV病毒的S基因或C基因，并通過設置標準曲線，實現樣品中HBV的準確定量。