[發明專利]一種細胞內MTDH結合代謝物的鑒定方法

有效

• 申請號: 201811451731.2
• 申請日: 2018-11-30
• 公開（公告）號: CN111257482B
• 公開（公告）日: 2021-11-09
• 發明（設計）人: 王穩;樸海龍
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/08;G01N33/532;G01N21/76
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種細胞內MTDH結合代謝物的鑒定方法，其特征在于：

1）利用蛋白質親和純化手段富集細胞內空載蛋白與融合MTDH蛋白；具體為：采用表面裝載鏈霉親和素的瓊脂糖珠，對細胞內表達有生物素片段的融合MTDH蛋白以及對照空載體表達蛋白進行親和富集；

2）鑒定細胞內與MTDH發生原位結合的代謝物小分子；具體為：對代謝物進行質譜鑒定，比較對照蛋白組與融合MTDH蛋白組的代謝物豐度差異，從而鑒定出與MTDH相互作用的代謝物

通過在HEK293T中過表達目的蛋白，結合免疫共沉淀的方法，獲得較高含量的空載蛋白與融合MTDH蛋白；

利用蛋白質親和純化手段富集細胞內空載蛋白與融合MTDH蛋白，包括以下步驟：

1)轉染前一天接種HEK293T細胞于2個5-10cm 細胞培養皿；

2)分別在293T細胞中轉染6-10μg SFB-N與SFB-MTDH質粒；

3)轉染48-60h后吸去培養基, 加入5-8ml PBS洗去剩余培養基，吸走PBS，將細胞培養皿置于液氮中淬滅；

4) 每個培養皿加入1-1.2 ml 配制的NETN細胞裂解液，提取蛋白；

5）每管蛋白裂解液中加入15-20μl鏈霉親和素瓊脂糖珠，4℃富集2-4h；

其中空載蛋白與融合MTDH蛋白結合的代謝物分別提取為：

1）采用0.8ml離心式過濾柱,1500rpm, 4℃離心5min,分離瓊脂糖珠-蛋白質-代謝物結合復合體與NETN裂解液；加入800μl PBS，1500rpm, 4℃離心5min，洗瓊脂糖珠-蛋白質-代謝物結合復合體，重復清洗過程2次；

2）200μl三蒸水重懸瓊脂糖珠-蛋白質-代謝物結合復合體至另外的EP管，加入800μl含有終濃度為5μg/ml正十三酸標準樣品的甲醇靜置提取30min；

3）1500rpm, 4℃離心10min，真空濃縮干燥6-8h至樣品完全干燥；

代謝樣品衍生及GC-MS分析為：

1）基于TMS的兩步法衍生：每管樣品中加入 50μL含20mg/mL，吡啶的甲氧胺溶液，渦旋2min,超聲5min后，置于 37℃水浴中肟化反應 1.5 h，以保護羰基，然后加入 40μL MSTFA(N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺)，置于 37 ℃水浴中硅烷化反應 1 h；硅烷化反應完成后，離心取上清液70μL用于后續的 GC-MS 分析；

GC-MS分析：色譜柱為DB-5 MS熔融石英毛細管柱，30m×0.25mm×0.25μm，進樣量1μL，分流比1:10；進樣口溫度為300℃；氦氣作為載氣，流速40cm/s，恒線速模式；程序升溫條件為：柱溫在70℃保持3min，以5℃/min升至300℃，保持10min；離子化采用70eV的電子轟擊電離源EI；傳輸線和離子源溫度分別為280℃和230℃；溶劑切割時間5.0min，MS采集范圍33-600m/z，采集頻率4scans/s；

利用GC-MS對空載蛋白組與融合MTDH蛋白組中提取的代謝物進行分析，通過對其中代謝物的定性定量，鑒定出膽固醇為細胞內MTDH原位結合的代謝物之一。

2.根據權利要求1所述的的鑒定方法，其特征在于：對親和純化體系內的代謝物進行提取，衍生后進行質譜分析鑒定富集后的空載蛋白與融合MTDH蛋白結合的代謝物，還包括以下步驟：

1）提取代謝物后的瓊脂糖珠-蛋白質結合復合體進行SDS-PAGE電泳，將凝膠上的蛋白轉印至0.45μm的PVDF膜上；

2）利用Flag特異抗體，通過Western Blot結合化學發光表征蛋白富集結果。

3.根據權利要求1或2所述的鑒定方法，其特征在于，通過比較空載蛋白組與融合MTDH蛋白組之間的代謝物含量差異，鑒定出細胞內可能與MTDH結合的代謝物。