[發明專利]一種農桿菌介導結合浸沒式培養獲得轉基因植物的方法

在審

• 申請號: 201811451201.8
• 申請日: 2018-11-30
• 公開（公告）號: CN109355307A
• 公開（公告）日: 2019-02-19
• 發明（設計）人: 張木清;王繼華;徐世強
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 廣州鼎賢知識產權代理有限公司 44502
• 代理人: 覃現凱

1.一種農桿菌介導結合浸沒式培養獲得轉基因植物的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將外源基因導入到農桿菌中，得到含有外源基因的農桿菌；將含有外源基因的農桿菌培養至對數生長期，收集菌體，將菌體重懸于含100～120μmol/L乙酰丁香酮的MS液體培養基中，得到轉化菌液；

(2)侵染

將受體材料置于(1)制備的轉化菌液中浸泡培養后，將受體材料表面的液體吸干；再將受體材料置于共培養培養基中，于25±2℃暗培養3-4天，得到侵染受體材料；

所述共培養培養基為在MS培養基基礎上，添加2～2.5mg/L 2,4-D、2～2.5mg/L 6-BA、100～120μmol/L AS和5.5～6.0g/L瓊脂粉，再調節pH至5.5～6.0；或者，所述共培養培養基為在MS培養基基礎上，添加2～2.5mg/L 6-BA、100～120μmol/L AS和5.5～6.0g/L瓊脂粉，再調節pH至pH 5.5～6.0；

(3)通過間歇浸沒培養進行分化與抗性篩選

將侵染受體材料置于氣泵驅動RITA間歇浸沒式生物反應器的培養容器中，在所述RITA反應器的營養液儲存容器加入選擇培養基，同時進行抗性篩選和再生，

所述選擇培養基是在MS液體培養基的基礎上，添加1～1.5mg/L 2,4-D、3～3.5mg/L 6-BA、500～600mg/L Amp以及包括抗生素和除草劑的植物激素和與載體抗性標記相應的篩選物質，再調節pH至5.8～6.0；或者，所述選擇培養基是在MS液體培養基的基礎上，添加3～3.5mg/L6-BA、500～600mg/L Amp以及包括抗生素和除草劑的植物激素和與載體抗性標記相應的篩選物質，再調節pH至5.8～6.0；

(4)待苗高為0.5-1cm時，將苗轉移至改良MS培養基中進行生根誘導，得到生根的植株；

改良MS培養基是在MS培養基的基礎上，添加1～1.5mg/L萘乙酸、0.5～1.0mg/L 3-吲哚丁酸、500～600mg/L Amp以及包括抗生素和除草劑的植物激素和與載體抗性標記相應的篩選物質，再調節pH至5.8～6.0；或者，改良MS培養基是在MS培養基的基礎上，添加1～1.5mg/L萘乙酸、0.5～1.0mg/L 3-吲哚丁酸、500～600mg/L Amp以及包括抗生素和除草劑的植物激素和與載體抗性標記相應的篩選物質，再調節pH至5.8～6.0；

(5)將生根的植株移栽，得到轉基因植株。

2.如權利要求1所述的農桿菌介導結合浸沒式培養獲得轉基因植物的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的外源基因為：膦絲菌素乙酰轉移酶基因Bar。

3.如權利要求1所述的農桿菌介導結合浸沒式培養獲得轉基因植物的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的將含有外源基因的農桿菌培養得到轉化菌液的方法為：

將含有外源基因的農桿菌接種于YEB液體培養基中，于28℃搖床過夜，得到第一菌液；

再按體積百分比1％接種量將第一菌液轉接入新的一份YEB液體培養基中培養至OD600為0.4～0.6，得到第二菌液；

將第二菌液在4℃、6000～7000rpm的條件下離心收集菌體；

將菌體轉移至含100μmol/L AS的MS液體培養基中重新懸浮沉淀，培養至OD600為0.4～0.6，得到第三菌液；

將第三菌液轉入含100μmol/L AS的MS液體培養基中，28℃搖床上培養至OD600到0.4～0.7。

4.如權利要求3所述的農桿菌介導結合浸沒式培養獲得轉基因植物的方法，其特征在于，所述YEB液體培養基中含有抗生素。

5.如權利要求1所述的農桿菌介導結合浸沒式培養獲得轉基因植物的方法，其特征在于，步驟(2)中所述浸泡培養的時間為20～35min。

6.如權利要求1所述的農桿菌介導結合浸沒式培養獲得轉基因植物的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的受體材料為厚度為0.3～0.5cm的無菌植物葉片愈傷組織或胚性細胞。