[發明專利]一種液質聯用測定血漿中地塞米松濃度的方法

在審

• 申請號: 201811451019.2
• 申請日: 2018-11-30
• 公開（公告）號: CN109541108A
• 公開（公告）日: 2019-03-29
• 發明（設計）人: 林明弘
• 申請（專利權）人: 徐州佳生醫藥科技有限公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/06
• 代理公司: 徐州市淮海專利事務所 32205
• 代理人: 李妮

1.一種液質聯用測定血漿中地塞米松濃度的方法，其特征在于：血漿樣品經預處理后經高效液相色譜-串聯質譜檢測其濃度，具體方法包括以下步驟：

(1)血漿樣品預處理：

血漿以K₂EDTA為抗凝劑，以地塞米松-d5為內標；于貼有標簽的玻璃試管中加入100uL的血漿樣品，加入5uL的體積比為1：1的乙腈水溶液，混勻后加入20uL的0.01ng/uL的內標地塞米松-d5溶液，混勻后加入20uL1mol/L的磷酸氫二鉀，混勻后再向試管中加入3mL甲基叔丁基醚，渦旋混合1min，于20℃以3000rpm離心5min，取有機溶液層及標簽轉移至另一干凈試管，于純凈空氣流下，35℃蒸發干燥至少15min至試管完全干燥，于試管中回溶400uL有機溶液，有機溶液為水：乙腈：甲酸按照體積比70：30：0.1混合得到的混合物，渦旋混勻1min后，將試管中的溶液轉移至96深孔板中，作為測試樣品待檢測；

(2)試樣測定：

取10uL測試樣品注入高效液相色譜-串聯質譜儀中，檢測樣品中地塞米松和內標地塞米松-d5的色譜峰，并據此計算所述血漿樣品中的地塞米松濃度；

(3)液相色譜測定，條件為：

色譜柱：Agilent ZORBAX XDB-C18，5um，柱規格為50×2.1mm；色譜柱溫：40℃；流動相A：水/甲酸的體積百分比為100/0.1；流動相B：乙腈/甲酸的體積百分比為100/0.1；洗液：乙腈/水的體積百分比為50/50；自動進樣器溫度為15℃；梯度洗脫，流速為0.4mL/min，進樣量為10uL，分析時間3.5min；

(4)質譜測定，條件為：

離子源為電噴霧離子源，噴霧電壓為3800V，霧化溫度為480℃，噴霧氣壓力為30Psi，輔助加熱氣壓力為30Psi，氣簾氣壓力為20Psi，碰撞氣壓力為8Psi，去簇電壓分別為25eV的地塞米松和地塞米松-d5；碰撞室入口電壓分別為8eV的地塞米松和地塞米松-d5；碰撞電壓分別為15eV的地塞米松和地塞米松-d5；碰撞室出口電壓分別為15eV的地塞米松和地塞米松-d5；正離子方式檢測；掃描方式為多重反應監測；

用于定量分析的離子反應分別為：m/z393.2→m/z355.3，其為地塞米松；和m/z398.2→m/z360.2，其為地塞米松-d5。

2.根據權利要求1所述的一種液質聯用測定血漿中地塞米松濃度的方法，其特征在于：所述步驟(3)中梯度洗脫的程序為：

。

3.根據權利要求1或2所述的一種液質聯用測定血漿中地塞米松濃度的方法，其特征在于：所述步驟(2)中，采用內標法，以地塞米松和內標地塞米松-d5的峰面積比值帶入標準曲線方程計算所述血漿樣品中的地塞米松的濃度。

4.根據權利要求3所述的一種液質聯用測定血漿中地塞米松濃度的方法，其特征在于：所述標準曲線方程的建立包括以下步驟：

取100uL空白血漿10份置于貼有標簽的玻璃試管中，以貯備液的形式添加5uL濃度分別為0.002ng/μL、0.004ng/μL、0.01ng/μL、0.02ng/μL、0.04ng/μL、0.1ng/μL、0.24ng/μL、0.4ng/μL的地塞米松溶液至最低定量下限樣本、標樣1、標樣2、標樣3、標樣4、標樣5、標樣6、最高定量上限樣本中，分別添加5μl體積比為1：1的乙腈水溶液至空白樣本和零濃度樣本，混勻后分別向最低定量下限樣本、標樣1、標樣2、標樣3、標樣4、標樣5、標樣6、最高定量上限樣本、零濃度樣本中加入20uL的0.01ng/uL的內標地塞米松-d5溶液，向空白樣本中加入20uL的體積比為1：1的乙腈水溶液，混勻后分別向10份樣本中加入20uL1mol/L的磷酸氫二鉀，混勻后再向試管中加入3mL甲基叔丁基醚，渦旋混合1min，于20℃以3000rpm離心5min，取有機溶液層及標簽轉移至另一干凈試管，于純凈空氣流下，35℃蒸發干燥至少15min至試管完全干燥，于試管中回溶400uL有機溶液，有機溶液為水：乙腈：甲酸按照體積比70：30：0.1混合得到的混合物，渦旋混勻1min后，將試管中的溶液轉移至96深孔板中，分別作為10份標準樣品待檢測；

分別取10uL標準樣品注入高效液相色譜-串聯質譜儀中，檢測樣品中的地塞米松和內標地塞米松-d5的色譜峰，并據此得到標準曲線，以用于計算所述血漿中的地塞米松的濃度。