[發(fā)明專利]一種能催化西他沙星五元環(huán)關(guān)鍵中間體的ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811449438.2
• 申請日: 2018-11-30
• 公開（公告）號: CN109486784B
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 廖祥儒;翟李欣;賴英杰;殷方榮;蔡宇杰;管政兵
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12P13/00;C12P13/04;C12P17/10
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開了一種能催化西他沙星五元環(huán)關(guān)鍵中間體的ω?轉(zhuǎn)氨酶突變體，屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過對ω?轉(zhuǎn)氨酶晶體結(jié)構(gòu)中B因子較高的氨基酸進行定點突變，即將ω?轉(zhuǎn)氨酶32位置處的Y突變成L，190位置處的S突變成A，212位置處的L突變成M，215位置處的I突變成M，得到了一種可以催化西他沙星五元環(huán)關(guān)鍵中間體的ω?轉(zhuǎn)氨酶突變體。本發(fā)明突變體Y32L/S190A/L212M/I215M催化效率Kcat/Km為0.64min^?1·mM^?1，催化(S)?5?benzyl?5?azaspiro[2.4]heptan?7?amine生成5?benzyl?5?azaspiro[2.4]heptan?7?one時，突變體的5?benzyl?5?azaspiro[2.4]heptan?7?one最大轉(zhuǎn)化率為79.02％。本發(fā)明得到的突變體適用于在工業(yè)上手性合成西他沙星五元環(huán)關(guān)鍵中間體的應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種能催化西他沙星五元環(huán)關(guān)鍵中間體的ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體，屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

2008年日本第一制藥三共株式會社開發(fā)的廣譜喹諾酮類抗菌藥——西他沙星(Sitafloxacin Hydrate)對許多臨床常見耐氟喹諾酮類菌株具有良好殺菌作用，用于治療嚴重難治性感染性疾病。與其他喹諾酮藥物相比，本品的日治療費用低，治療效果和安全性好。但其合成工藝中的關(guān)鍵技術(shù)難點是不對稱合成西他沙星五元環(huán)關(guān)鍵中間體。該工藝的不穩(wěn)定、成本高、難以放大生產(chǎn)的技術(shù)限制嚴重限制了西他沙星的生產(chǎn)。相較于手性胺類藥物的化學合成方法，其生物合成方法的酶不對稱催化以其底物專一性、立體選擇性強、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)勢受到關(guān)注。因此酶不對稱催化的生物合成方法更具有研究和應(yīng)用價值。

轉(zhuǎn)氨酶(aminotransferase，transaminase)屬于轉(zhuǎn)移酶類，通常用于催化氨基由氨基供體化合物轉(zhuǎn)移至氨基受體化合物。根據(jù)不同可變區(qū)的差異，將文獻報道的不同來源的轉(zhuǎn)氨酶的蛋白質(zhì)序列進行比較和聚類分析，再根據(jù)親水位點的疊加和迭代對比，我們可以將轉(zhuǎn)氨酶分為4類。其中ω-轉(zhuǎn)氨酶屬于第二亞族，常用于制備手性胺及非天然氨基酸，如β-氨基酸。因為ω-轉(zhuǎn)氨酶的大口袋結(jié)合區(qū)域比天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AspATs)和芳香族轉(zhuǎn)氨酶(AroATs)稍大，所以它可能能夠結(jié)合比天然氨基酸體積較大的底物。轉(zhuǎn)氨酶催化的反應(yīng)主要有不對稱合成和動力學拆分，利用酶催化合成手性胺類化合物，不僅可以大大的提高產(chǎn)率，還可以避免原料的浪費，以制得大量的光學純度較高的手性胺類化合物。ω-轉(zhuǎn)氨酶不僅可以應(yīng)用于對外消旋體的拆分，還可以催化前體酮底物不對稱合成手性胺類化合物。ω-轉(zhuǎn)氨酶在制備手性胺類化合物范圍較廣，因此更具有應(yīng)用價值。

在蛋白質(zhì)分子改造中，目前常用的方法有理性設(shè)計、非理性設(shè)計和半理性設(shè)計。三種方法的主要區(qū)別在于是否充分了解酶蛋白分子結(jié)構(gòu)以及是否需要使用生物信息學軟件進行計算和預(yù)測。其中理性設(shè)計具有實驗成本低、簡單方便和時間短等優(yōu)點。

雖然ω-轉(zhuǎn)氨酶有著巨大的應(yīng)用和研究價值，但是從野生菌中篩選出的ω-轉(zhuǎn)氨酶無法特異性催化西他沙星五元環(huán)關(guān)鍵中間體，使之無法進一步將該ω-轉(zhuǎn)氨酶應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，大大降低了開發(fā)和運用。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明將來自Bacillus pumilus W3的ω-轉(zhuǎn)氨酶(一種來自短小芽孢桿菌的ω-轉(zhuǎn)氨酶及在生物胺化中的應(yīng)用.201811219769.7)進行異源表達和定點突變改造，使改造后的ω-轉(zhuǎn)氨酶能夠特異性催化西他沙星五元環(huán)關(guān)鍵中間體，對ω-轉(zhuǎn)氨酶的工業(yè)化應(yīng)用及推廣具有深遠的技術(shù)指導(dǎo)意義。

本發(fā)明的ω-轉(zhuǎn)氨酶突變體，與親本ω-轉(zhuǎn)氨酶相比能夠特異性催化西他沙星五元環(huán)關(guān)鍵中間體。所述親本基因與短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus W3)ω-轉(zhuǎn)氨酶基因(Sequence ID：MH196528)一致，所述作為突變用的質(zhì)粒模板為攜帶天然ω-轉(zhuǎn)氨酶編碼基因的載體ota3/pColdⅡ(申請?zhí)枺篊N201811219769.7)。