[發明專利]一種溫控裂解質粒及其構建以及在菌蛻制備中的應用

在審

• 申請號: 201811448234.7
• 申請日: 2018-11-30
• 公開（公告）號: CN109402156A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 汪瑋;汪浩;施慧;許文軍
• 申請（專利權）人: 浙江省海洋水產研究所
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/65;C12N15/66;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 寧波誠源專利事務所有限公司 33102
• 代理人: 袁忠衛;葉桂萍

1.一種溫控裂解質粒，其特征在于：所述溫控裂解質粒為具有卡那霉素抗性的溫控裂解質粒220E-Kn，該220E-Kn的核苷酸序列為SEQ ID NO：1。

2.一種構建如權利要求1所述的溫控裂解質粒的方法，其特征在于：包括有如下步驟：

(1)以噬菌體PhiX174 RFI DNA為模板，Elysis-F2、Elysis-R2為引物，擴增出噬菌體PhiX174裂解基因E，連接于pEasy-T simple克隆載體，經測序無誤后，通過EcoR I和Sal I雙酶切，與相同酶切的pBV220載體連接，獲得攜帶裂解基因E的pBV220，命名為220E；

(2)以構建好的220E質粒為模板，以220F、220R為引物，通過PCR反向擴增，獲得線性化的、兩端帶有重組臂的220E質粒；以攜帶卡那霉素抗性基因的pET30(a)質粒為模板，該攜帶卡那霉素抗性基因的pET30(a)質粒的核苷酸序列為SEQ ID NO：2，并以Km-F、Kn-R為引物，通過PCR擴增獲得兩端帶有重組臂的卡那霉素抗性基因220E-Kn；

(3)將步驟(2)獲得的線性載體和片段進行同源重組，重組產物轉化Trans1-T1感受態細胞，通過卡那霉素平板篩選陽性轉化子，并用載體引物pBV220-F和Elysis-R2、Kn-F和Kn-R兩隊引物進行PCR驗證，確認獲得的轉化子含有攜帶正確重組片段的裂解質粒。

3.根據權利要求2所述構建溫控裂解質粒的方法，其特征在于：所述步驟(1)中引物Elysis-F2的核苷酸序列為：gaattcATGGTACGCTGGACTTTGTGGGATACCCTCGCTTT；Elysis-R2的核苷酸序列為：aaaagtcgacTCACTCCTTCCGCACGTAAT。

4.根據權利要求2所述構建溫控裂解質粒的方法，其特征在于：所述步驟(2)中引物220F的核苷酸序列為：ctgtcagaccaagtttactcATATATACTTT；

220R的核苷酸序列為：actcttcctttttcaatattATTGAAGC。

5.根據權利要求2所述構建溫控裂解質粒的方法，其特征在于：所述步驟(2)中引物Km-F的核苷酸序列為：aatattgaaaaaggaagagtATGAGCCATATTCAACGGGAAA；

Kn-R的核苷酸序列為：gagtaaacttggtctgacagTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAA。

6.一種如權利要求1所述的溫控裂解質粒在制備菌蛻中的應用。