[發明專利]一種調控轉錄激活因子以降低黃酒酵母尿素積累的方法

有效

• 申請號: 201811443815.1
• 申請日: 2018-11-29
• 公開（公告）號: CN109517746B
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 周景文;陳堅;張偉平;曾偉主;夏小樂;堵國成;方芳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/90;C12G3/022;C12R1/865
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

1.一種降低黃酒酵母尿素積累的方法，其特征在于，以黃酒酵母XZ-11為出發菌株，進行了MATa,Δura3,Δtrp1,TOR1 S1972R,Δfpr1的改進，構建重組黃酒酵母JNZ01，通過在含雷帕霉素的體系中培養黃酒酵母JNZ01，將轉錄激活因子Gln3或Gat1定位于細胞核，調控氮代謝阻遏效應轉錄激活因子不受氮源條件影響，降低黃酒酵母發酵過程中尿素的積累；所述黃酒酵母JNZ01的基因組上分別融合表達GLN3、FKBP12或GAT1、FKBP12，并在質粒上融合表達SPT15、FRB；通過在含雷帕霉素的體系中培養該菌株，使FKBP12和FRB結合，使Gln3或Gat1在細胞核定位蛋白Spt15的作用下轉移到細胞核。

2.一種構建尿素積累能力降低的黃酒酵母的方法，其特征在于，所述方法是以黃酒酵母XZ-11為出發菌株，進行了MATa,Δura3,Δtrp1,TOR1 S1972R,Δfpr1的改進，構建重組黃酒酵母JNZ01，在重組黃酒酵母JNZ01的基因組上融合表達GLN3、FKBP12，并在質粒上融合表達SPT15、FRB；通過在含雷帕霉素的體系中培養該菌株，使FKBP12和FRB結合，使Gln3在細胞核定位蛋白Spt15的作用下轉移到細胞核；

或，在重組黃酒酵母JNZ01的基因組上融合表達GAT1、FKBP12，并在質粒上融合表達SPT15、FRB；通過在含雷帕霉素的體系中培養該菌株，使FKBP12和FRB結合，使Gat1在細胞核定位蛋白Spt15的作用下轉移到細胞核。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)構建GLN3、FKBP12重組框和GAT1、FKBP12重組框；

(2)將GLN3、FKBP12重組框和GAT1、FKBP12重組框分別整合到重組黃酒酵母JNZ01基因組上GLN3和GAT1基因之后；

(3)消除CRISPR-Cas9系統質粒，分別得到重組黃酒酵母JNZ02和JNZ03；

(4)構建SPT15、FRB融合表達框；

(5)將SPT15、FRB融合表達框轉化至重組黃酒酵母JNZ02和JNZ03中，得到重組黃酒酵母JNZ04和JNZ05；

(6)在重組黃酒酵母JNZ04和JNZ05的培養過程中，向培養基中添加雷帕霉素，誘導Gln3和Gat1定位于細胞核；

所述重組黃酒酵母JNZ01的構建方法為：以黃酒酵母XZ-11為出發菌株，敲除其FPR1基因，并突變TOR1基因編碼的蛋白第1972位絲氨酸殘基為精氨酸。

4.應用權利要求2或3所述方法構建的尿素積累能力降低的黃酒酵母，所述黃酒酵母在含雷帕霉素的培養基中能夠促使FKBP12與FRB結合，使轉錄激活因子Gln3或Gat1在細胞核定位蛋白Spt15的作用下定位于細胞核。

5.權利要求4所述的黃酒酵母在食品領域的應用。

6.權利要求4所述的黃酒酵母在制備黃酒方面的應用。

7.一種應用權利要求4所述黃酒酵母的發酵方法，其特征在于，將所述黃酒酵母接種至含有雷帕霉素的發酵培養基中，于28～30℃發酵。

8.一種降低黃酒中尿素或EC含量的方法，其特征在于，以權利要求4所述的黃酒酵母作為發酵菌株進行發酵。