[發明專利]魚類自然殺傷細胞殺傷細菌感染的單核/巨噬細胞能力的測定方法有效

申請號：	201811442073.0	申請日：	2018-11-29
公開（公告）號：	CN109468361B	公開（公告）日：	2021-11-02
發明（設計）人：	汪新艷;呂夢圓;張娜;周紅	申請（專利權）人：	電子科技大學
主分類號：	C12Q1/06	分類號：	C12Q1/06;C12Q1/02
代理公司：	成都正華專利代理事務所(普通合伙) 51229	代理人：	郭艷艷
地址：	611731 四川省成***	國省代碼：	四川;51
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摘要：
搜索關鍵詞：	魚類自然殺傷細胞細菌感染單核巨噬細胞能力測定方法
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【說明書】：

本發明公開了一種魚類自然殺傷細胞殺傷細菌感染的單核/巨噬細胞能力的測定方法，包括以下步驟：分離魚頭腎白細胞；采用細胞貼壁法制備魚單核/巨噬細胞；遲鈍愛德華菌感染單核/巨噬細胞；將魚頭腎白細胞用IL?2刺激48h，接著用無菌PBS緩沖液洗滌2?3次，制得自然殺傷細胞；自然殺傷細胞與遲鈍愛德華菌感染的單核/巨噬細胞共孵育，然后接種平板，根據平板上的菌落數目判斷殺傷能力。本發明通過IL?2誘導產生的魚自然殺傷細胞，對遲鈍愛德華菌感染的單核/巨噬細胞具有殺傷作用，根據共孵育后菌落數目多少便可判斷其殺傷能力大小，該方法簡單有效，可準確判斷自然殺傷細胞對感染后的單核/巨噬細胞的殺傷能力。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種魚類自然殺傷細胞殺傷細菌感染的單核/巨噬細胞能力的測定方法。

背景技術

魚類的免疫系統是由非特異性免疫和特異性免疫組成。魚類的免疫系統亦由免疫組織和器官、免疫細胞和體液免疫因子組成。而免疫細胞有兩類：一是淋巴細胞，主要進行特異性免疫反應；另一類是吞噬細胞，是非特異性免疫的關鍵成分，在抵御微生物感染方面具有重要作用。非特異性免疫系統在魚類抵御病原生物入侵時發揮著更為重要的作用。巨噬細胞是一種白血球，源自單核細胞，主要是以固定或游離細胞的形態對細胞殘片和病原體進行吞噬和消化，再激活淋巴球等免疫細胞，使之對病原體做出反應，阻止其擴散和生長，所以巨噬細胞在魚類免疫過程中占有極其重要的作用。但巨噬細胞被細菌感染后導致魚類產生不良癥狀，影響魚類的生存，魚類自然殺傷細胞會發揮作用將其殺傷，但如何判斷其殺傷能力則是亟待解決的問題。

發明內容

針對現有技術中存在的上述問題，本發明提供一種魚類自然殺傷細胞殺傷細菌感染的單核/巨噬細胞能力的測定方法，該方法可簡單有效地判斷自然殺傷細胞殺傷細菌感染的單核/巨噬細胞的能力。

為實現上述目的，本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種魚類自然殺傷細胞殺傷細菌感染的單核/巨噬細胞能力的測定方法，包括以下步驟：

(1)分離魚頭腎白細胞；

(2)采用細胞貼壁法制備魚單核/巨噬細胞；

(3)遲鈍愛德華菌感染單核/巨噬細胞；

(4)將魚頭腎白細胞用濃度為8-12ng/mL的IL-2刺激48h，接著用無菌PBS緩沖液洗滌2-3次，制得魚類自然殺傷細胞；

(5)將自然殺傷細胞與遲鈍愛德華菌感染的單核/巨噬細胞共孵育3.5-4.5h后吸取上清，用無菌PBS緩沖液反復洗滌細胞5-6次，向剩余細胞中加入1％Triton X-100裂解細胞4-6min，然后反復吹打裂解后的液體，并將裂解后的液體與無菌PBS緩沖液混勻；

(6)步驟(5)所得混勻液體涂到無抗生素的LB平板上，培養過夜，統計平板上的菌落數目，根據菌落數目測定魚類自然殺傷細胞對細菌感染的單核/巨噬細胞的殺傷能力，菌落數目少的說明殺傷能力強。

進一步地，步驟(1)中的具體過程為：

①在無菌條件下處死魚，用無菌工具取出頭腎，置于RPMI1640+10％FBS+1％A⁺/A⁺的培養基中，用培養基洗滌頭腎2-3次，然后再在RPMI1640+10％FBS+1％A⁺/A⁺的培養基中輕輕擠壓頭腎組織，使頭腎組織中的細胞滲出，收集細胞懸液至新的離心管中，重復該步驟3-4次；