[發明專利]成纖維前體細胞培養及其鑒定方法

在審

• 申請號: 201811439219.6
• 申請日: 2018-11-29
• 公開（公告）號: CN109554334A
• 公開（公告）日: 2019-04-02
• 發明（設計）人: 張磊
• 申請（專利權）人: 北京華宣醫療美容診所有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12Q1/686;G01N15/14;G01N33/68
• 代理公司: 北京中企鴻陽知識產權代理事務所(普通合伙) 11487
• 代理人: 李文麗

1.一種成纖維前體細胞培養及其鑒定方法，按照先后順序包括以下步驟：

(1)：TAF的培養：取人大腿皮膚樣品切塊后用PBS中沖洗，再加入DMEM培養液，于培養箱中傳代培養，以MTT法測定TAF的生長曲線，實驗選取P₅-P₁₀代的細胞；

(2)：RNA提取和PT-PCR：提取上述細胞的RNA，取高純度RNA進行PCR檢測，PCR產物再經凝膠電泳分析；

(3)：流式細胞儀檢測：取P₅代TAF細胞沖洗過濾，調整細胞濃度，每管分別加入PE標記的CD90、CD105、同型對照但熒光標記抗體，低溫處理后，進行流式細胞儀檢測；

(4)：免疫熒光檢測：將TAF細胞與Brdu共同培養，傳代擴增培養，應用抗Brdu的抗體進行檢測，將人大腿皮皮膚組織塊固定，包埋，切片后，用抗I型膠原的單克隆抗體4℃孵育過夜，再用TITC標記的山羊二抗染色并觀察；

(5)：誘導分化：取TAF細胞，接種到細胞培養皿中貼壁培養，更換為誘導培養液誘導培養，再更換為維持培養液維持，然后更換為誘導培養液，依次循環，采用油紅O染色，再觀察；

(6)：克隆成型：配制瓊脂溶液，滅菌，至于細胞培養箱中靜置曬干，取TAF細胞加入DMEM培養基和瓊脂溶液中培養，再觀察并統計克隆數。

2.根據權利要求1所述的成纖維前體細胞培養及其鑒定方法，其特征在于，步驟(1)中，所述DMEM培養液包括DMEM、10％FBS、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素，培養條件為37℃、5％CO₂培養箱中培養。

3.根據權利要求1所述的成纖維前體細胞培養及其鑒定方法，其特征在于，步驟(2)中，PCR檢測的特異性的基因包括：HLA-I，HLA-DR，RT-PCR。

4.根據權利要求3所述的成纖維前體細胞培養及其鑒定方法，其特征在于，步驟(2)中，PCR檢測反應循環參數為：95℃預變性5min；94℃變性30S，55℃退火45S,72℃延伸10min。

5.根據權利要求1所述的成纖維前體細胞培養及其鑒定方法，其特征在于，步驟(5)中，所述誘導培養液包括DMEM、10％FBS、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、1μmol/L地塞米松、1.7μmol/L胰島素、0.2mmol/L吲哚美辛、0.5mmol/L IBMX。

6.根據權利要求1所述的成纖維前體細胞培養及其鑒定方法，其特征在于，步驟(5)中，所述維持培養液包括DMEM、10％FBS、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、1.7μmol/L胰島素。