[發明專利]一種嬰幼兒排泄物中酸性糖及酸性糖衍生物的分析方法

在審

• 申請號: 201811438772.8
• 申請日: 2018-11-28
• 公開（公告）號: CN111239311A
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發明（設計）人: 梁鑫淼;李佳齊;郭志謀;閆競宇;金高娃
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種嬰幼兒排泄物中酸性糖及酸性糖衍生物的分析方法，其特征在于：嬰幼兒排泄物中酸性糖及酸性糖衍生物均質提取、沉淀除蛋白，經在線系統凈化柱除色素、乳糖及中性糖，獲得酸性糖及酸性糖衍生物餾分，獲得的酸性糖及酸性糖衍生物餾分進入親水作用色譜(HILIC)柱進行分離，親水作用色譜(HILIC)柱流出組分進入檢測系統進行檢測，獲得嬰幼兒排泄物酸性糖及酸性糖衍生物的結構組分分析，同時根據各酸性糖及酸性糖衍生物在本分析體系下所繪制的標準曲線，得到嬰幼兒排泄物中酸性糖及酸性糖衍生物的絕對含量信息。

2.按照權利要求1所述的分析方法，其特征在于：排泄物中糖類及酸性糖衍生物均質提取步驟為：取排泄物，加入其0.5-5倍體積量的糖類的良溶劑，渦旋震蕩不少于5秒，超聲不少于1分鐘，而后500-50000g離心5-500分鐘，提取1-5次后，取出上層透明溶液即完成排泄物中糖類及酸性糖衍生物均質提取。

3.按照權利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述沉淀除蛋白步驟為：取排泄物中均質提取得到的酸性糖及酸性糖衍生物提取清液，加入1-5倍體積量的有機溶劑混勻，于0-10℃靜置2-48小時后，0-10℃，500-50000g離心不少于5分鐘，取出上層清液，離心1-5次后蒸干，得到排泄物中糖類及酸性糖衍生物除蛋白樣品；

所述有機溶劑有甲醇、乙醇、乙腈、丙酮中的一種或幾種。

4.按照權利要求1所述的分析方法，其特征在于：在線系統包括三元泵，自動進樣器，柱溫箱，切換閥(二位置六通或十二通)，檢測器。

5.按照權利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述在線系統凈化柱凈化酸性糖及酸性糖衍生物的步驟為：取經過生物均質提取、沉淀除蛋白后的排泄物樣品，以20-90％有機溶劑水溶液溶解該樣品，以具有靜電排斥作用的親水材料為色譜柱固定相，流動相為水和有機溶劑或緩沖鹽溶液和有機溶劑，使用等度或梯度方法進行洗脫，酸性糖及酸性糖衍生物餾分直接進入串聯的親水作用色譜(HILIC)柱進行分離。

6.按照權利要求5所述的分析方法，其特征在于：在線系統凈化酸性糖及酸性糖衍生物的方法需要除去干擾檢測的乳糖、中性糖以及可能污染檢測器的色素、脂質等，其優化具體操作如下：

a)取經過生物均質提取、沉淀除蛋白后的排泄物樣品溶解液為有機溶液甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和水混合溶液的比例為20-90％

b)凈化柱填料為硅膠或硅膠表面鍵合極性基團的填料，所鍵合的極性基團有氨基酸、酰胺、氨基、羧基、糖基和兩性離子等中的一種或幾種；

c)洗脫液中的有機溶劑有：甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、異丙酮中的一種或幾種；

d)所選擇緩沖鹽類型為甲酸銨緩沖鹽、乙酸銨緩沖鹽、碳酸氫銨緩沖鹽中的一種，其于流動相中的濃度為0-200mM，pH 6-10；

e)流動相水或緩沖鹽水溶液和有機溶劑作為洗脫液的比例為5/95～95/5；

f)色譜柱內徑為2.1-10mm；分析方法的流速為0.1-2BV/min；

g)酸性糖及酸性糖衍生物餾分收集窗口為0-10BV，收集流出液。

7.按照權利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述親水作用色譜(HILIC)柱進行分離為：酸性糖及酸性糖衍生物餾分直接被捕集到HILIC柱，再進行分離分析，流動相為水和有機溶劑或緩沖鹽水溶液和有機溶劑，使用等度或梯度放大進行洗脫，檢測，流動相為水和有機溶劑或緩沖鹽水溶液和有機溶劑，使用等度或梯度方法進行洗脫，檢測。

所述親水作用色譜(HILIC)柱中填料為表面帶有正電荷的親水作用色譜材料，包括氨基酸、酰胺基、兩性離子、糖基中的一種或幾種。

8.按照權利要求7所述分析方法，其特征在于：優化色譜柱操作參數，包括流速、柱溫和檢測器，及閥切換時間，具體操作如下：

a)流速為0.1-2BV/min；

b)色譜柱內徑為2.1-10mm

c)柱溫為15-60℃；

d)檢測器為質譜、電噴霧或蒸發光；

e)閥切換時間為0-10BV。