[發明專利]用于檢測慢性鼻竇炎伴鼻息肉亞型的ELISA試劑盒及其制備方法

在審

• 申請號: 201811437289.8
• 申請日: 2018-11-28
• 公開（公告）號: CN109709329A
• 公開（公告）日: 2019-05-03
• 發明（設計）人: 張羅;王成碩;閆冰;王陽
• 申請（專利權）人: 張羅;王成碩;閆冰;王陽;北京市耳鼻咽喉科研究所;首都醫科大學附屬北京同仁醫院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/535
• 代理公司: 北京智匯東方知識產權代理事務所(普通合伙) 11391
• 代理人: 康正德;陳智勇

1.一種用于檢測慢性鼻竇炎伴鼻息肉亞型的ELISA試劑盒，其特征在于：包括包被有夏科雷登氏結晶蛋白CLC抗體的酶標板。

2.根據權利要求1所述的用于檢測慢性鼻竇炎伴鼻息肉亞型的ELISA試劑盒，其特征在于：所述包被有夏科雷登氏結晶蛋白CLC抗體為小鼠抗人CLC單克隆抗體。

3.根據權利要求1所述的用于檢測慢性鼻竇炎伴鼻息肉亞型的ELISA試劑盒，其特征在于：所述酶標板的每個微孔內所述夏科雷登氏結晶蛋白CLC抗體的包被量為0.1～1μg。

4.根據權利要求1所述的用于檢測慢性鼻竇炎伴鼻息肉亞型的ELISA試劑盒，其特征在于：進一步還包括夏科雷登氏結晶蛋白CLC標準品及其標準品稀釋液、TMB底物顯色液、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液、終止溶液和洗滌液。

5.根據權利要求4所述的用于檢測慢性鼻竇炎伴鼻息肉亞型的ELISA試劑盒，其特征在于：所述標準品為重組CLC蛋白；

所述標準稀釋液包括吐溫20、牛血清白蛋白和磷酸緩沖鹽溶液；

所述檢測溶液A工作液包括采用標準品稀釋液稀釋成濃度1～10μg/mL的生物素標記的人CLC抗體；

所述檢測溶液B工作液包括采用標準品稀釋液稀釋成濃度0.5～5μg/mL的抗生物素抗體結合的辣根過氧化物酶；

所述終止溶液為硫酸；

所述洗滌液包括吐溫20和磷酸緩沖鹽溶液。

6.根據權利要求1所述的用于檢測慢性鼻竇炎伴鼻息肉亞型的ELISA試劑盒，其特征在于：包被有夏科雷登氏結晶蛋白CLC抗體的酶標板的制備方法，包括以下步驟：將小鼠抗人CLC單克隆抗體用磷酸緩沖鹽溶液稀釋，取酶標板，向其加入稀釋好的小鼠抗人CLC單克隆抗體，4℃過夜棄上清后洗板，每孔加入封閉液，再次棄上清后洗板。

7.一種權利要求1～6任一項所述的用于檢測慢性鼻竇炎伴鼻息肉亞型的ELISA試劑盒的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟一：制備包被有夏科雷登氏結晶蛋白CLC抗體：將小鼠抗人CLC單克隆抗體用磷酸緩沖鹽溶液稀釋；

步驟二：制備包被有夏科雷登氏結晶蛋白CLC抗體的酶標板：取酶標板，每孔加入稀釋好的小鼠抗人CLC單克隆抗體，4℃過夜棄上清后加入洗滌液洗板，每孔加入封閉液，再次棄上清后加入洗滌液洗板；

步驟三：倍比稀釋標準品：取標準品，向其加入標準品稀釋液，制備得到濃度為Xng/mL的標準品，取濃度為Xng/mL的標準品進行倍比稀釋，依次倍比稀釋濃度為：Xng/mL，0.5Xng/mL，0.25Xng/mL，0.625Xng/mL，0.3125Xng/mL，0.15625Xng/mL，0.078125Xng/mL；

步驟三：樣品稀釋：取出樣本至室溫，并進行梯度稀釋處理；

步驟四：裝樣：取步驟二制備的包被有夏科雷登氏結晶蛋白CLC抗體的酶標板，每孔分別依次加入步驟三的倍比稀釋后的標準品和步驟四的稀釋后的樣品，同時設置添加有標準品稀釋液的空白孔，孵育后加入洗滌液洗板；

步驟五：制備檢測溶液A工作液：取生物素標記的人CLC抗體采用標準品稀釋液稀釋成1～10μg/mL后加入至酶標板的每個孔內，覆膜并孵育后加入洗滌液洗板；

步驟六：制備檢測溶液B工作液：采用標準品稀釋液稀釋成濃度0.5～5μg/mL的抗生物素抗體結合的辣根過氧化物酶后加入至酶標板的每個孔內，覆膜并孵育后加入洗滌液洗板；

步驟七：顯色：取TMB加入同等體積0.75％雙氧水后制備得到TBM底物顯色液并加入至酶標板的每個孔內，當觀察添加有濃度為Xng/mL的標準品的孔變成棕黃色后，酶標板的每個孔加入終止溶液，待添加有濃度為Xng/mL的標準品的孔由黃色變為藍色時，采用酶標儀450nm檢測波長檢測，550nm-570nm參考波長比色，制作標準曲線計算樣品濃度值。