[發明專利]一種研究化療急性期腫瘤細胞耐藥基因表達的新方法

有效

• 申請號: 201811431920.3
• 申請日: 2018-11-28
• 公開（公告）號: CN110564847B
• 公開（公告）日: 2023-02-03
• 發明（設計）人: 王雅梅;周萍;王俐勇
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6869;C12Q1/6837
• 代理公司: 北京睿陽聯合知識產權代理有限公司 11758
• 代理人: 景鵬;張穎

1.一種研究化療藥物作用急性期的腫瘤細胞耐藥基因表達的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

步驟一、MTT法檢測宮頸癌HeLa細胞對化療藥的敏感性

(1)HeLa細胞在完全培養基：DMEM/F12、10％小牛血清、1％青霉素、1％硫酸鏈霉素，37℃、5％CO₂恒溫培養箱中培養；

(2)取對數生長期的HeLa細胞，密度為70％-80％，用含10％胎小牛血清的培養液配成單個細胞懸液，以每孔4000個細胞接種到96孔板，每孔體積100μL，共接種3個96孔板37℃、5％CO₂恒溫培養箱中培養24小時后給予0、2.5、5、7.5、10μM不同濃度的順鉑，同時以化療藥絲裂霉素C作為平行對照，絲裂霉素C濃度為0、0.75、1.5、3、6μM；兩個加藥組均設不加細胞含培養液的空白對照孔，每個濃度設6個復孔，每孔100μL培養液，四個96孔板，分別在培養24、48、72小時后，每孔加10μL MTT試劑，在培養箱中37℃繼續培養4小時，然后用酶標儀檢測570nm波長的吸光度；

(3)通過24-72小時HeLa細胞對化療藥的敏感性檢測，實驗的結果顯示HeLa細胞在5μM的順鉑加藥72小時，細胞生存率在5.01％，HeLa細胞在1.5μM的絲裂霉素C加藥72小時，細胞生存率在7.81％；符合存活的細胞接近腫瘤干細胞在腫瘤細胞集群中占10％左右的比例，選擇在此時間點停止藥物處理，將存活細胞用正常培養液，37℃、5％CO₂恒溫培養箱中恢復培養48小時；

步驟二、提取細胞RNA

(1)取步驟一恢復培養48小時的細胞，棄培養液；用冰預冷的PBS洗細胞兩次，再加1mLPBS在冰上用細胞刮刮取細胞，4℃，3000rpm離心10分鐘，收集細胞；用PBS緩沖液懸浮細胞，并對細胞進行計數；再次離心收集細胞；

使用Ambion公司mirVana miRNA Isolation Kit試劑盒，按照試劑盒的操作說明提取HeLa細胞RNA；

(2)RNA濃度及純度測定NanoDrop2000分光光度計測定RNA濃度，260/280比值；

(3)電泳檢測RNA的質量，稱取0.2g瓊脂糖，加0.5×TBE 20mL，微波爐內融化，冷卻至65℃，加入EB 0.7μL灌入置膠槽，避光室溫放置30min；用槍頭吸取RNA樣品上樣，5V/cm的電壓，瓊脂糖膠電泳25min；凝膠成像分析系統檢測所提取RNA樣品的質量；

步驟三、全基因組基因表芯片檢測樣品制備

全基因組基因表芯片樣品的制備方法同實步驟一，HeLa細胞在5μM的順鉑加藥72小時，細胞生存率5.01％；1.5μM的絲裂霉素C加藥72小時，細胞生存率7.81％；同時以不加藥的細胞作為對照；72小時后停止藥物處理，將存活細胞用正常培養液恢復培養48小時；分別提取3組HeLa細胞的RNA；用NanoDrop2000分光光度計測定RNA樣品濃度；OD_260/280值：對照組2.11，順鉑組2.05，絲裂霉素C組2.07，RNA濃度：對照組170ng/μL，順鉑組90ng/μL，絲裂霉素C組70ng/μL；制備好的樣品直接進行轉錄組測序，按照轉錄組測序的方法構建轉錄組測序文庫，或進行全基因組基因表芯片的檢測；

步驟四、全基因組基因表達芯片掃描

用BeadSation500激光共聚焦掃描系統依次對HumanHT-12 v4 Expression Bead Chip進行掃描，獲取圖像信號，將圖像信號轉化為數字信號；用Genome studio軟件對得到的cy3圖象文件通過劃格，確定雜交點范圍；過濾背景噪音提取得到基因表達的熒光信號強度值，最后以列表形式輸出；

步驟五、全基因組基因表達芯片的數據分析

(1)全基因組基因表達芯片的數據初步分析

用Genome Studio分析軟件將掃描獲取的熒光信號強度按立方樣條函數法歸一化；使用Genome Studio軟件中的Genome View分析三組HeLa細胞全基因組基因表達水平；三組樣品全基因組水平基因表達差異的熱圖；基因表達水平從低表達的綠色區到高表達的紅色區，結果顯示在三組樣品中HeLa細胞加化療藥處理組與未加藥處理組高表達基因有顯著的差異，加絲裂霉素C和順鉑處理的兩組之間高表達基因的表達量也有一定的差異；

(2)全基因組基因表達芯片中差異基因的數據分析

三組樣品高表達基因中，設定P值0.05；且表達信號值組12000，組2，組32000的基因共篩選出777個基因；其中與組1相比，組2和組3表達顯著上調的前4個基因中顯著上調的HSPB1基因是具有抗凋亡活性的，與腫瘤細胞耐藥相關的基因；顯著下調的MIF基因與細胞增殖活性相關，RPS3基因與蛋白的生物合成相關；表明細胞在化療藥物處理下，細胞增殖與蛋白質合成的水平顯著下降；

其中所述腫瘤為宮頸癌。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞為真核細胞。