[發明專利]一株產硫酸軟骨素ABC裂解酶的重組酵母菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201811425963.0
• 申請日: 2018-11-27
• 公開（公告）號: CN109988723B
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發明（設計）人: 吳凌天;郗棟南;賴淑涵;朱益波;劉欣雨;霍薪宇;劉學潤
• 申請（專利權）人: 常熟理工學院
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/60;C12N15/81;C12P19/26;C12M1/40;C12M1/34;C12M1/02;C12M1/00;C12R1/84
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 丁靜靜;肖明芳

1.一株產硫酸軟骨素ABC裂解酶的重組酵母菌，其特征在于，該重組酵母菌中導入了硫酸軟骨素ABC裂解酶基因，所述硫酸軟骨素ABC裂解酶基因的核苷酸序列如SEQID NO. 1所示；

包括如下步驟：將SEQID NO. 1所示的硫酸軟骨素ABC裂解酶基因導入pPIC9K質粒，得到重組質粒，將重組質粒轉化酵母菌，既得到產硫酸軟骨素ABC裂解酶的重組酵母菌；

所述的酵母菌為畢赤酵母Pichia pastoris GS115。

2.權利要求1所述產硫酸軟骨素ABC裂解酶的重組酵母菌在制備硫酸軟骨素ABC裂解酶、小分子硫酸軟骨素中的應用。

3.一種小分子硫酸軟骨素的生產方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1) 小分子硫酸軟骨素制備：

將大分子硫酸軟骨素A粉末配置成水溶液，泵入酶膜反應器的降解反應釜（10）中，向其中加入硫酸軟骨素ABC裂解酶，使硫酸軟骨素ABC裂解酶的總酶活與硫酸軟骨素質量的比例為1 × 10⁴ ~ 6 × 10⁴ U：1 kg，控制轉速50 ~ 200 rpm，溫度20 ~ 40 °C；當降解反應進行0.5 ~ 1.5 h后，開啟酶膜反應器的超濾膜系統（12），小分子硫酸軟骨素透過超濾膜進入濃縮釜（13）中，大分子硫酸軟骨素被截留返回到降解反應釜（10）中繼續降解，硫酸軟骨素ABC裂解酶則被截留返回到降解反應釜（10）中循環利用；當濃縮釜（13）中料液體積是濃縮釜體積的1/3時開啟納濾系統（14），水分子透過納濾膜進入降解反應釜（10）中被循環利用，小分子硫酸軟骨素被截留返回到濃縮釜（13）中繼續濃縮；

(2) 除菌：對步驟(1)濃縮釜（13）中得到的納濾截留液進行除菌處理，得到無菌濾液；

(3) 濃縮：將步驟(2)得到無菌濾液通過三效濃縮器濃縮，得到無菌濃縮液；

(4) 干燥：將步驟(3)得到的無菌濃縮液加入噴霧干燥塔內，進風溫度185 °C，出風溫度90 °C，進行干燥，得到小分子硫酸軟骨素成品。

4.根據權利要求3所述小分子硫酸軟骨素的生產方法，其特征在于，所述硫酸軟骨素ABC裂解酶按照如下方法制備：

將權利要求1所述的產硫酸軟骨素ABC裂解酶的重組酵母菌YPD液體培養基中，28 °C過夜培養至OD₆₆₀值在3 ~ 8，離心，收集菌泥；用產酶培養基重懸重組酵母細胞，每天補加0.5~ 3%的甲醇，28 °C，220 rpm條件下培養3 ~ 7天；

所述產酶培養基的配方如下：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，3 g/L K₂HPO₄，12 g/LKH₂PO₄，13.4 g/L無氨基酸酵母氮源， 4 × 10^-4 g/L生物素，甲醇5 mL/L。