[發明專利]以博落回葉片原液為底物合成血根堿和白屈菜紅堿的方法

有效

• 申請號: 201811423064.7
• 申請日: 2018-11-27
• 公開（公告）號: CN109468350B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發明（設計）人: 黃鵬;曾建國
• 申請（專利權）人: 湖南美可達生物資源股份有限公司
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12N15/53;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/865
• 代理公司: 長沙楚為知識產權代理事務所(普通合伙) 43217
• 代理人: 陶祥琲

1.一種以博落回葉片原液為底物合成血根堿和白屈菜紅堿的方法，其特征在于，是一種將博落回葉片原液直接進行生物轉化，使原液中的原阿片堿與別隱品堿轉化成高價值的血根堿與白屈菜紅堿的方法，具體包括如下步驟：

S1、博落回葉片原液前處理，具體如下：

（1）將博落回葉片放于35～45℃的恒溫干燥箱中烘干，并粉碎得葉片粉末備用；

（2）將步驟（1）制得的葉片粉末按比例加入一定體積pH=8.0的TE緩沖溶液中，配置呈一定比例的緩沖液，即前體溶液；前體溶液中葉片粉末的濃度為0.2～0.8g/mL；將所述前體溶液放入高壓蒸汽滅菌鍋中110～120℃滅菌25～35 min或者放入超聲波清洗器中超聲25～35 min；

（3）之后，將所述前體溶液4500～5500rpm離心4～6 min，上清液過0.2～0.25μm濾膜，即得；

S2、構建酵母工程菌：將博落回普羅托品-6-羥基化酶基因與輔酶基因CPR、二氫苯并菲啶氧化酶基因一起構建到表達載體上，然后轉入酵母工程菌中，并進行轉化，獲得重組酵母工程菌株；

所述普羅托品-6-羥基化酶（P6H）基因包括MC11229、MC11218及MC11229opt，其核苷酸序列分別如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、 SEQ ID No.3所示；

所述二氫苯并菲啶氧化酶（DBOX）基因包括MC6408、MC6407以及MC6408 opt，其核苷酸序列分別如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示；

所述輔酶基因包括CuCPR，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；

S3、以步驟S1前處理后的博落回葉片原液作為底物，前體飼喂步驟S2構建的酵母工程菌，溫度30℃ 下，發酵培養24小時；

S4、收集步驟S3培養后的酵母工程菌，裂解菌體、分離純化，即得血根堿和白屈菜紅堿。

2.根據權利要求1所述的以博落回葉片原液為底物合成血根堿和白屈菜紅堿的方法，其特征在于，所述表達載體的質粒選自PYES2。

3.根據權利要求1所述的以博落回葉片原液為底物合成血根堿和白屈菜紅堿的方法，其特征在于，所述酵母工程菌株的宿主菌選自酵母菌株ivf。