[發明專利]一種拯救麻疹Schwarz/Moraten疫苗株的系統和方法

在審

• 申請號: 201811421283.1
• 申請日: 2018-11-23
• 公開（公告）號: CN111218475A
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發明（設計）人: 劉蘭軍;張勇俠;陳宗香;高雅麗;康莊
• 申請（專利權）人: 成都生物制品研究所有限責任公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/45;C12N7/00;A61K39/155;A61P31/14
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

本發明提供了一種麻疹Schwarz/Moraten疫苗株反向遺傳學方法，包括如下步驟：(1)病毒全長質粒pT7MV_sw和輔助質粒與哺乳動物細胞混合；(2)電擊轉染；(3)培養細胞，收獲病毒；所述全長質粒包含T7啟動子和麻疹Schwarz/Moraten疫苗株基因組或反基因組序列；所述輔助質粒包括pT7?SWN(帶有T7啟動子和麻疹N蛋白編碼序列)、pT7?SWP(帶有T7啟動子和麻疹P蛋白編碼序列)、pT7?SWL(帶有T7啟動子和麻疹L蛋白編碼序列)、pT7?T7RNAP(帶有T7啟動子和T7RNA聚合酶編碼序列)、pCDIBP?T7RNAP(帶有CMV啟動子和T7RNA聚合酶編碼序列)。本發明能成功拯救出麻疹Schwarz/Moraten疫苗株，具有很好的應用前景。

技術領域

本發明涉及病毒反向遺傳學領域，特別涉及一種麻疹Schwarz/Moraten疫苗株的拯救系統和方法。

背景技術

麻疹病毒(Measlesvirus,Mev)屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus)，基因組全長為15894個核苷酸[1]。1954年Enders和Peebles 在人、猴腎細胞培養物上分離成功第一株麻疹病毒野毒株Edmonston，并在組織培養物中連續傳代[2]。由于麻疹具有極強的感染性，因此在接觸前接種麻疹疫苗是控制麻疹唯一合理的方法。

Edmonston野毒株是當前世界上廣泛使用的麻疹減毒疫苗株的來源株，例如AIK-C，Zagreb，Schwarz以及Moraten疫苗株[3]。Edmonston野毒株在人腎細胞、羊膜細胞、雞胚細胞上傳代適應，因傳代次數不同產生兩種麻疹減毒株Edmonston A和B。1963年，默克公司上市銷售全球第一個麻疹疫苗 Edmonston B株，該疫苗于1975年退市。減毒株Edmonston A和B分別在雞胚細胞上繼續傳代及雞胚細胞上低溫傳代適應獲得更為減毒的Schwarz和Moraten疫苗株。GSK公司麻腮風水痘四聯苗中的麻疹疫苗株Schwarz共傳156 代，默克公司麻腮風水痘四聯苗中的麻疹疫苗株Moraten共傳128代，研究表明，兩個疫苗株序列在核苷酸及蛋白質水平完全一致[4]。目前， Schwarz/Moraten疫苗株是世界范圍內最廣泛使用的麻疹疫苗株[5]。

為了獲得性狀穩定的疫苗，通常采取反向遺傳學的方法制備減毒活病毒。該方法通常將病毒株全長cDNA與編碼蛋白N、P、L的基因克隆在T7啟動子控制的質粒上，將全長質粒及輔助質粒共轉染宿主細胞，質粒需在T7RNA 聚合酶的作用下進行轉錄完成病毒的拯救。T7RNA聚合酶通常通過轉染可表達T7RNA聚合酶的重組痘病毒或能穩定表達T7RNA聚合酶的工程化細胞提供。

將重組痘病毒轉入T7RNA聚合酶獲得的工程化細胞用于疫苗生產，后期純化時無法徹底去除重組痘病毒，無法滿足GMP對病毒候選疫苗臨床應用的要求，因此采用該方法拯救所得病毒不能用于疫苗的開發和生產。

可持續表達T7RNA聚合酶的工程化細胞拯救重組病毒無需引入重組痘病毒，但在使用過程中也受到一定的限制。一方面，構建并維持能穩定表達 T7RNA聚合酶工程細胞存在一定的難度；另一方面，構建所得的工程化細胞基因組序列在原有細胞基礎上有插入，為保證疫苗臨床應用的安全性，將工程化細胞應用到疫苗的開發、生產過程中需要經過驗證，驗證工程化細胞并將其用于疫苗的生產難度較大。因此，對于需要在人類身上進行臨床試驗進行評估的候選疫苗的開發，在其病毒株的生產過程中使用能表達T7RNA聚合酶的病毒或工程化細胞，都會使得整個疫苗從開發到臨床應用過程復雜化，加大批準難度。

綜上，使用常規的病毒拯救體系無法滿足麻疹Schwarz/Moraten株疫苗開發的需求。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種麻疹Schwarz/Moraten疫苗株拯救系統和拯救方法。