[發明專利]一種基于病毒鑒定的質譜數據庫建立方法

在審

• 申請號: 201811412814.0
• 申請日: 2018-11-23
• 公開（公告）號: CN111220686A
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發明（設計）人: 張麗華;韓國斌;劉路寬;楊開廣;梁振;張玉奎
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62;G01N33/569
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種基于病毒鑒定的質譜數據庫建立方法，其特征在于：

(1)病毒樣品的預處理：通過超濾、離心、萃取、透析方法中的一種或兩種及以上方法將病毒樣品進行濃縮純化；

蛋白提取：在濃縮純化的病毒樣品中加入酸并充分混合，然后再加入溶劑并充分混合，得到預處理樣品；

(2)病毒數據庫的譜圖采集及數據庫建立：將預處理得到的病毒樣品與CHCA(α-氰基-4-羥基肉桂酸)、SA(芥子酸)、DHB(2,5-二羥基苯甲酸)基質中的一種或兩種以上均點于靶板上，點靶的方式為分層點樣、混合點樣、“三明治”點樣方法中的一種或兩種以上，進行病毒MALDI譜圖的采集，采集得到的譜圖進行數據庫建立。

2.根據權利要求1所述的病毒數據庫的譜圖采集及數據庫建立方法，特征在于：

點靶基質溶于溶劑中進行點靶，該溶劑含有酸；

優選基質為SA，SA基質溶于溶劑，該溶劑含有酸；通過分層點樣、混合點樣、“三明治”點樣方法中的一種或兩種及以上點于靶板上，用該SA基質與病毒樣品進行病毒譜圖的采集。

3.根據權利要求1或2所述的病毒數據庫的譜圖采集及數據庫建立方法，其特征在于：選用“三明治”點樣方法，首先取基質溶液滴在MALDI靶板上，待干燥后再取預處理的病毒樣品滴在上面，然后自然晾干；待上述病毒樣品干燥后，再在上面滴加基質溶液，最終干燥后，調整并設置MALDI參數后進行質譜譜圖采集。

4.根據權利要求1、2或3所述的病毒數據庫的譜圖采集及數據庫建立方法，其特征在于：

數據采集過程為：對MALDI的激光能量，頻率，轟擊次數，靶板相對移動步長，離子源電壓，檢測范圍以及檢測器增益參數進行設置，之后MALDI檢測，采集病毒樣品質譜數據；

數據庫建立：對Biotyper的質譜分子量范圍，分辨率，平滑，基線校正，歸一化以及峰提取參數進行設置，處理質譜數據，之后建立基于病毒的質譜數據庫。

5.根據權利要求1、2或3所述的病毒數據庫的譜圖采集及數據庫建立方法，其特征在于：

權利要求1步驟1)酸為甲酸、乙酸、三氟乙酸、鹽酸、硝酸、硫酸等中的一種或兩種及以上；其體積分數為10％～100％；溶劑為水、甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、乙腈、丙酮、氯仿、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜，二氯甲烷和乙醚中的一種或兩種以上；

權利要求1步驟2)或權利要求2或3中點靶基質所用酸為甲酸、乙酸、三氟乙酸、鹽酸、硝酸、硫酸等中的一種或兩種及以上；其于溶劑中的體積分數為0.01％～1％；溶劑為水、甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、乙腈、丙酮、氯仿、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜，二氯甲烷和乙醚中的一種或兩種以上。

6.根據權利要求1所述的病毒樣品的預處理方法及病毒數據庫的建立方法，其特征在于：病毒為黃病毒科、皰疹病毒科、副粘液病毒科、小RNA病毒科、彈狀病毒科、正黏液病毒科、腺病毒科中的一種或兩種以上。

7.根據權利要求6中所述的病毒樣品的預處理方法及病毒數據庫的建立方法，其特征在于：病毒樣品的培養、擴增、純化過程為：

(1)先用DMEM培養基在所需溫度和CO₂濃度條件下進行細胞培養；

(2)病毒復蘇后，在上述細胞液中進行擴增；

(3)取上述病毒的上清液，通過離心去除細胞碎片，并收集上清；然后將收集的上清用β-丙內酯滅活，并通過蔗糖密度梯度離心進行純化，最后得到的病毒顆粒用1mL PBS重懸，作為病毒儲備液。

8.根據權利要求1所述的病毒樣品的預處理方法及病毒數據庫的建立方法，其特征在于：基于病毒鑒定的質譜數據庫，可用于生物安全、公共衛生領域內病毒的快速分析鑒定。