[發明專利]一種羰基還原酶突變體mut-AcCR(I147V/G152L)及其應用與編碼基因

有效

• 申請號: 201811412383.8
• 申請日: 2018-11-25
• 公開（公告）號: CN109355265B
• 公開（公告）日: 2021-07-20
• 發明（設計）人: 婁文勇;魏萍;宗敏華
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12P7/24
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 何淑珍;江裕強

本發明提供一種羰基還原酶突變體mut?AcCR(I147V/G152L)及其應用與編碼基因。羰基還原酶AcCR能夠催化多種潛手性羰基化合物不對稱還原，但是其對于芳香族化合物的活性及底物耐受性較低，本發明采用酶分子改造手段將糖基化還原酶AcCR進行突變，獲得突變體mut?AcCR(I147V/G152L)，突變體對于2?羥基苯乙酮的比酶活可達6.4 U/mg，比未突變前的羰基還原酶的比活力提高17.4倍。底物耐受濃度從50 mmol/L提高至200 mmol/L。本發明所述羰基還原酶突變體在羰基化合物的不對稱還原中被廣泛應用。

技術領域

本發明屬于酶分子改造領域，具體涉及一種羰基還原酶突變體mut-AcCR(I144V/G152L)及其應用與編碼該突變體的基因。

背景技術

光學純的手性醇及其衍生物是合成手性藥物、液晶材料、香精香料、農藥的重要手性中間體，在醫藥及其他化工領域占有重要位置。手性醇可以通過化學法和和生物法合成。化學合成法一般需要高溫高壓等嚴苛的條件；采用大量的有機試劑，環境污染嚴重；制備過程復雜，往往存在多次保護和去保護步驟；更重要的是化學方法得到的產物的對映體選擇性低。相比于化學法，生物法一般在常溫常壓下反應，條件溫和，設備要求低，環境污染小，底物專一性強，具有較高的立體選擇性和區域選擇性，產物對映體純度高等優點。生物催化合成手性醇正在以強勁的勢頭在制備藥物中間體中發揮越來越重要的作用。基于綠色化學和可持續發展的原則，生物催化制備手性醇是既綠色又可持續的合成途徑。

羰基還原酶作為一種高效、高選擇性的可用于不對稱還原反應的生物催化劑，常用于制備具有光學活性的手性化合物。羰基還原酶在催化不對稱還原反應時存在兩個極具挑戰性的問題，并且限制其進一步應用于不對稱合成反應。第一，很多高價值手性醇的潛手性底物的溶解性很低或不可溶于酶的天然介質。這個缺點可以通過采用非水介質提高底物溶解度的方法得以解決，如采用有機溶劑、離子液體、超臨界二氧化碳等單或雙相反應介質進行生物催化反應。一部分羰基還原酶以這些溶劑為介質，在高底物濃度時亦表現出較高的酶活。但是，一些羰基還原酶的活性、選擇性和穩定性在非水介質中往往會出現不同程度的降低。因此，在選擇羰基還原酶非水反應介質時需要對反應介質進行篩選。第二，由于羰基還原酶具有嚴格的底物特異性、輔酶依賴性以及生理環境的不適應等特點，使羰基還原酶并非總能有效地完成一個特定的立體專一性合成反應，如在高濃度底物、高溫、極端pH等環境下，羰基還原酶往往表現出活性低、選擇性和穩定性差等不足。

隨著基因組學和蛋白質組學的發展，科學家將更多的目光投入到蛋白質工程上。以定向進化和理性設計等為基礎，對蛋白序列進行修飾，改變其結構，進而影響其催化性能，使其具有更好的區域和立體選擇性、更高的穩定性和底物耐受性，為手性醇的合成提供更有效的方式。將蛋白質工程更好地應用于酶分子改造，可以使以酶或細胞為主導的生物催化在底物、介質、反應器等其他方面得到進一步的發展，使蛋白質工程取得的成果得到更有效、更持續性地應用。

本課題組前期研究中，從醋酸桿菌Acetobacter sp.CCTCC M209061中克隆表達一種羰基還原酶。該羰基還原酶能夠催化多種底物進行不對稱還原反應，具有良好的立體選擇性。但是，該羰基還原酶對于2-羥基苯乙酮等羰基化合物的酶活較低，對于這類底物的耐受性比較差，只有在底物濃度較低時才能達到良好的催化效果。

發明內容

為了克服該酶活力低及底物耐受性差的缺點，本發明的首要目的在于提供一種活性和底物耐受性有明顯提高的遵循反-Prelog規則的羰基還原酶突變體mut-AcCR(I147V/G152L)。

本發明的另一個目的在于提供上述羰基還原酶突變體mut-AcCR(I147V/G152L)的基因及氨基酸序列。

本發明的再一個目的在于提供上述羰基還原酶突變體mut-AcCR(I147V/G152L)的應用。

本發明的目的通過以下技術方案實現。