[發(fā)明專利]誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的培養(yǎng)方法，以及該方法所用的培養(yǎng)基

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811409257.7
• 申請(qǐng)日: 2018-11-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109456939A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉年
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京太東生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/077
• 分類號(hào): C12N5/077;C12N5/0775
• 代理公司: 北京超凡志成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11371
• 代理人: 鄧超

本發(fā)明涉及細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的培養(yǎng)方法，以及該方法所用的培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基中至少額外添加如下組分得到：TGF?β3 7～13ng/mL、地塞米松0.07～0.13μmol/L、抗壞血酸酯40～60μg/mL、1×ITS 0.7～1.3w/v％、L?脯氨酸30～50μg/mL以及丙酮酸鈉0.7～1.3mmol/L。本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)組分，并搭配特定的培養(yǎng)方法，提高了誘導(dǎo)速度，7天后即可形成堅(jiān)硬密實(shí)的軟骨，接種的所有間充質(zhì)干細(xì)胞都可分化會(huì)軟骨細(xì)胞，分化率提高。誘導(dǎo)后的軟骨小球，質(zhì)地密實(shí)，經(jīng)特異性染色顯示，均充分分化為軟骨細(xì)胞。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的培養(yǎng)方法，以及該方法所用的培養(yǎng)基。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)是中胚層來(lái)源的、具有高度自我更新能力和多向分化潛能的多能干細(xì)胞。事實(shí)上，MSC廣泛存在于全身多種組織中，幾乎來(lái)源于機(jī)體所有的組織器官，如骨髓、骨膜、脂肪組織、牙髓、滑膜、臍帶、胎盤、羊水及胎兒組織等。不同來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞具有相似的形態(tài)，表達(dá)相同的表面標(biāo)記，具有相似的生物學(xué)特性方面，如可在體外培養(yǎng)擴(kuò)增，并能在特定條件下分化為包括神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞在內(nèi)的多組織系統(tǒng)的細(xì)胞。MSC除了具有多向組織細(xì)胞分化能力之外，還在造血、免疫炎癥反應(yīng)、血管新生等人體重要功能中起重要調(diào)節(jié)作用。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細(xì)胞。臍帶間充質(zhì)是一類低免疫原性細(xì)胞，且具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞擁有MSC的全部特性，并且含量豐富，易于分離培養(yǎng)。

與其他來(lái)源的MSC相比，UC-MSC更原始，是介于胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞之間的干細(xì)胞，其增殖和分化能力比胚胎干細(xì)胞低，但明顯高于成體干細(xì)胞。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有多分化潛能，在特定的誘導(dǎo)條件下，UC-MSC不僅能分化為骨、軟骨、脂肪、肌腱等中胚層細(xì)胞，而且能夠向內(nèi)胚層組織細(xì)胞(如心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞)和外胚層組織細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞)分化。UC-MSC不具致瘤性，能在不同的誘導(dǎo)條件及合適的體內(nèi)生長(zhǎng)微環(huán)境中，安全地定向分化為不同的組織細(xì)胞系，具有修復(fù)各種組織和器官的能力。

MSCs被誘導(dǎo)分化成軟骨細(xì)胞是一個(gè)受多種因素控制的復(fù)雜過(guò)程，受多種細(xì)胞因子和激素的調(diào)控。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)是發(fā)現(xiàn)最早的能夠誘發(fā)軟骨生成的生物活性分子，不但能促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，還能刺激Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達(dá)，提高M(jìn)SCs分化成軟骨的能力。胰島素在軟骨組織工程中也具有十分重要的意義，外源性胰島素可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的有絲分裂和細(xì)胞外基質(zhì)的Ⅱ型膠原及GAG合成。

地塞米松(DEX)是一種長(zhǎng)效腎上腺糖皮質(zhì)激素，糖皮質(zhì)激素是體外誘導(dǎo)人MSCs分化成軟骨細(xì)胞所必需的。DEX能夠直接與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，上調(diào)聚集蛋白聚糖、皮連蛋白及Ⅺ型膠原基因的表達(dá)，誘導(dǎo)MSCs向軟骨細(xì)胞分化，并且能夠加強(qiáng)的作用。

一些其他的生物活性因子和化學(xué)藥品也能促進(jìn)MSC的成軟骨分化，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)、催乳素(PRL)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、脯氨酸、丙酮酸鈉等都已被證實(shí)具有有效提升MSCs分化成軟骨細(xì)胞的能力。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨分化是一個(gè)多因素控制的過(guò)程，需要優(yōu)化多種組分比例。現(xiàn)有誘導(dǎo)技術(shù)誘導(dǎo)分化率比較低，時(shí)間周期長(zhǎng)，需要14～28天左右才能形成軟骨，而且不能有效地使所有間充質(zhì)干細(xì)胞都分化為軟骨細(xì)胞，從而導(dǎo)致誘導(dǎo)后的軟骨密度低，不夠致密，軟骨品質(zhì)差，去分化速度快，不利于以后在組織工程中的使用。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容