[發明專利]水稻OsARF6基因在調控水稻種子粒型中的應用

有效

• 申請號: 201811406321.6
• 申請日: 2018-11-23
• 公開（公告）號: CN109371040B
• 公開（公告）日: 2021-04-27
• 發明（設計）人: 齊艷華;王梅;喬繼月
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;A01H5/10;A01H6/46
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 韓聰

1.核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的水稻OsARF6基因在調控水稻種子粒型中的應用。

2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，利用RNAi或CRISPR/CAS9技術降低水稻OsARF6基因編碼蛋白的表達或活性，進而獲得長粒型種子的水稻突變體。

3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述水稻突變體的氨基酸序列如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。

4.一種長粒型種子水稻的育種方法，其特征在于，包括：利用CRISPR/Cas9技術定點編輯核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的水稻OsARF6基因的靶位點，所述靶位點的序列分別為：GACGCTGCAGCCACTCAGCC，ACCACTGGCTAAATATGTAA。

5.如權利要求4所述的育種方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)針對所述的靶位點和pGTR質粒序列分段設計PCR引物，以pGTR質粒為模板進行PCR擴增，獲得含有pGTR質粒不同分段的PCR產物，將PCR產物回收并連接獲得含所述靶位點序列的線性化片段；

(2)以線性化片段為模塊，PCR擴增獲得含所述靶位點序列的目標產物，將目標產物連入終載體pRGEB質粒，構建得到CRISPR/Cas9重組載體；

(3)將CRISPR/Cas9重組載體轉入待基因編輯的受體水稻中，培育，篩選獲得含有Cas9序列標簽的T0代陽性苗；

(4)T0代陽性苗自交一代得到T1代苗，通過篩選獲得Cas9標簽去除的T1代苗，即得具有長粒型種子表型的水稻植株。

6.如權利要求5所述的育種方法，其特征在于，步驟(1)中，設計引物時，引入酶切位點，PCR擴增得到P1、P2、P3，利用酶切產生粘性末端，在連接酶的作用下連接得到線性長片段，采用的PCR引物為：

P1：

L5AD5-F：5’-CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCAACAAAGCACCAGTGG-3’；

gR3-R：5’-ATGGTCTCAGGCTGCAGCGTCTGCACCAGCCGGGAA-3’；

P2：

gR3-F：5’-TAGGTCTCCAGCCACTCAGCCGTTTTAGAGCTAGAA-3’；

gR4-R：5’-CGGGTCTCATTAGCCAGTGGTTGCACCAGCCGGG-3’；

P3：

gR4-F：5’-TAGGTCTCCCTAAATATGTAAGTTTTAGAGCTAGAA-3’；

L3AD5-R：5’-TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAACAAAAAAAAAAGCACCGACTCG-3’。

7.如權利要求5所述的育種方法，其特征在于，步驟(2)中，設計的PCR引物為：

S5AD5-F：5’-CG GGTCTC A GGCA GGATG GGCAGTCTG GGCA-3’；

S3AD5-R：5’-TA GGTCTC C AAAC GGATG AGCGACAGC AAAC-3’。