[發明專利]木薯U6啟動子基因及應用

有效

• 申請號: 201811405963.4
• 申請日: 2018-11-23
• 公開（公告）號: CN109486819B
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 趙輝;孔華;賀萍萍;郭安平;張雨良;張麗麗;郭靜遠;屈靜
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院三亞研究院;中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113
• 代理公司: 海口翔翔專利事務有限公司 46001
• 代理人: 張耀婷

本發明公開了3個木薯U6啟動子基因及應用，該3個啟動子序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，通過GUS染色瞬時表達驗證，能高效的在木薯上表達。在轉基因技術領域，這些啟動子不僅適用于木薯，除用于啟動功能基因表達外，在構建RNAi表達載體時可用于啟動發夾結構的表達，在CRISPR/Cas9系統中可用于啟動sgRNA引導序列的表達等。

技術領域

本發明屬生物技術領域，特別是植物轉基因技術領域，具體涉及木薯U6啟動子的克隆和應用。

背景技術

木薯(Manihot esculenta Crantz)屬大戟科(Euphorbiaceae)木薯屬(ManihotP.Mill.)植物，是世界三大薯類(木薯、甘薯和木薯)作物之一，同時也是熱帶地區繼水稻、玉米、高粱之后的第四大糧食作物，是熱帶和亞熱帶地區重要的熱能來源，為世界上近6億人提供食物。木薯廣泛分布于全球南、北緯30°之間的熱帶及部分亞熱帶地區。我國木薯主產區有海南、廣東、廣西、福建、云南，在四川、貴州、湖南、江西、浙江等地也有種植。木薯對光、熱和水資源的利用非常高，單位面積生物能產量幾乎高于其它栽培作物，具有抗旱、耐貧瘠、適應性廣以及儲藏根(塊根)淀粉含量高(占干重的85％)等獨特而優良的生物學特性。木薯淀粉是食品加工、工業變性淀粉、飼料和生物質產品(燃料乙醇)的重要原料。木薯已有幾千年的栽培歷史，因植株基因型高度雜合、基因冗余、花粉育性低、有性子代嚴重分離等自身特征和種質資源的局限性，其常規育種困難且進展較慢。

近年來，通過轉基因途徑改良木薯品種獲得階段性進展，例如在降低氰化物、提高塊根淀粉含量、改良直(支)淀粉比例以及抗病、耐寒、抗旱轉基因育種都取得良好進展。盡管如此，木薯轉基因育種仍然存在不少亟待解決的問題。其中，挖掘適合木薯本身的特異啟動子。目前廣泛用于木薯的啟動子是CaMV35s，CaMV35s并不適宜驅動塊根基因的表達。雖然已有馬鈴薯塊莖patatin蛋白特意啟動子、Pt214等相繼用于木薯轉化，但相較于水稻、小麥等糧食作物，木薯自身的啟動子資源相對匱乏。

U6啟動子是二型啟動子，與真核生物RNA聚合酶III結合后，負責轉錄U6RNA，這類啟動子的特點是幾乎所有啟動子元件(除了+1位的轉錄起點)都位于轉錄起始位點的上游，也即它對轉錄起點后的序列無特殊選擇或要求，能保證轉錄序列的結構特征。U6啟動子+1位是鳥苷酸。RNA聚合酶III啟動子識別的終止信號是連續4-5個胸苷酸，轉錄產物末端一般有4個尿苷酸。幾乎所有的真核生物都具有U6啟動子，U6啟動子在真核生物體內一般發現是啟動小片段，不帶PolyA尾的序列，由RNA聚合酶III聚合U6啟動子轉錄產生shRNA，經剪切后產生成熟siRNA，產生干擾效果；shRNA的表達量取決于啟動子的強弱，與同類的RNA聚合酶III的啟動子H1相比，U6啟動子啟動能力更強，表達時間也長。

目前，在轉基因技術領域，U6啟動子多用在構建RNAi表達載體上，用于啟動干擾發夾結構的表達；此外，隨著基因編輯技術的興起，U6啟動子也被開始廣泛用于CRISPR系統中sgRNA引導序列的啟動表達，以保證引導序列的結構特征。U6啟動子具有種屬特異性，在轉基因技術中，使用轉化物種本身或接近物種的U6啟動子能取得更高的的啟動效率。前人研究表明，人U6啟動子有幾個明顯的特點：1、具有TATA box，位于-30～-25bp，被Pol III轉錄；2、在轉錄起點上游-66～-47bp處存在PSE(proximal sequence element)，該元件是snRNA 激活因子蛋白復合物的結合位點；3、在-244～-214存在DSE(distal sequenceelement)；4、啟動子下游存在5'-TTTT-3'序列為Pol III提供轉錄終止信號；5、PSE和DSE之間的距離變化可顯著影響轉錄效率；6、+1位的G對轉錄效率影響較大。根據這些特點，在使用U6啟動子構建RNAi表達載體時，U6啟動子的長度最好在300bp左右，盡量不改變PSE和DSE的間距，同時保留TATA box和+1位的G，在下游應有5'-TTTTT-3'序列作為終止信號。另外可以根據需要在啟動子上游或終止信號下游設計測序引物序列、酶切位點等等。