[發(fā)明專利]一種用于提高卷枝毛霉產(chǎn)油量的二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811402942.7
• 申請(qǐng)日: 2018-11-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109628472A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋元達(dá);楊俊換;楊武;李少琦
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/31
• 分類號(hào): C12N15/31;C12N15/80;C12N1/15;C07K14/37;C12R1/785
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明涉及一種用于提高卷枝毛霉產(chǎn)油量的二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，屬于基因工程領(lǐng)域，本發(fā)明從高產(chǎn)油卷枝毛霉WJ11克隆獲得二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體dit基因，連接至整合型質(zhì)粒pMAT1552上，轉(zhuǎn)化到卷枝毛霉缺陷型菌株Mu402中，通過(guò)同源重組將dit基因整合到卷枝毛霉的基因組上，得到重組菌株Mc?Dit，最終實(shí)現(xiàn)了dit基因在卷枝毛霉MU402中的表達(dá)，過(guò)表達(dá)菌株Mc?Dit胞內(nèi)油脂脂肪酸組成變化不大，但在過(guò)表達(dá)菌株Mc?Dit菌株油脂總脂肪酸含量提了33.76%，胞內(nèi)油脂含量最多可以達(dá)到細(xì)胞干重的17.67%。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于提高卷枝毛霉產(chǎn)油量的二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)同源重組技術(shù)過(guò)量表達(dá)二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(dit)基因，大大提高卷枝毛霉中的油脂產(chǎn)量。

背景技術(shù)

現(xiàn)在，人民生活水平日益提高，越來(lái)越多的人重視身體健康與生活質(zhì)量。膳食油脂的營(yíng)養(yǎng)成分與慢性病的發(fā)生密切相關(guān)，油脂中重要的活性多不飽和脂肪酸，如γ-亞麻酸（GLA）、α-亞麻酸（ALA）、紫草酸（十八碳四烯酸、SDA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA），可以調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝，預(yù)防多種慢性疾病的發(fā)生。γ-亞麻酸為人體必需脂肪酸，是人體合成活性多不飽和脂肪酸的前體物質(zhì)，需要從膳食中獲得。目前工業(yè)化的γ-亞麻酸大多來(lái)源于植物，如月見(jiàn)草、玻璃苣油和黑加侖籽油。然而植物因受產(chǎn)地、氣候的影響，生長(zhǎng)周期短、產(chǎn)量不穩(wěn)定，不能滿足市場(chǎng)需求。因此，尋找新型油脂資源成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。產(chǎn)油微生物由于其油脂含量高，生長(zhǎng)周期短，碳源利用廣譜等特點(diǎn)備受關(guān)注，通過(guò)微生物產(chǎn)生的油脂以及其衍生品來(lái)代替部分植物資源，可能在未來(lái)生物產(chǎn)油產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮重要作用。產(chǎn)油微生物細(xì)胞工廠是指利用產(chǎn)油微生物，發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)添加過(guò)量的碳源，如碳水化合物、碳?xì)浠衔锏龋沟梦⑸锇麅?nèi)脂肪酸以甘油三酯的方式大量?jī)?chǔ)存在自身體內(nèi)，進(jìn)而將細(xì)胞轉(zhuǎn)變成工廠。

卷枝毛霉是全球首次利用微生物商業(yè)化培養(yǎng)生產(chǎn)油脂的菌株。卷枝毛霉被用來(lái)作為產(chǎn)油微生物研究的模式菌種，然而，本研究中分離獲得新菌株WJ11，其所產(chǎn)生的脂質(zhì)可以占到細(xì)胞干重的36%，且其基因組測(cè)序已完成，遺產(chǎn)背景與產(chǎn)油機(jī)制研究較為深入，同時(shí)其基因操作簡(jiǎn)單，遺傳工具較為齊全，比較適于進(jìn)行細(xì)胞工廠制備。卷枝毛霉能夠大量產(chǎn)生對(duì)人體具有重要生理功能的γ-亞麻酸 (GLA)，這也是其主要的商業(yè)價(jià)值。

二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(2-oxoglutarate/malate transporter，dit)基因是脂質(zhì)合成的關(guān)鍵因素之一。產(chǎn)油真菌通常在碳源充足，其它營(yíng)養(yǎng)成分（如氮、磷、硫等）缺乏的條件下，線粒體中三羧酸循環(huán)受阻，導(dǎo)致檸檬酸大量積累在線粒體中，此時(shí)檸檬酸被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中由檸檬酸裂解酶裂解產(chǎn)生脂肪酸合成底物乙酰輔酶A和草酸乙酰。乙酰輔酶A為細(xì)胞中油脂合成前體物質(zhì)，進(jìn)而通過(guò)生化反應(yīng)被用于合成脂肪酸，而脂肪酸則以甘油三酯的形式儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)，從而形成微生物油脂。據(jù)報(bào)道，二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體能夠?qū)⒓?xì)胞質(zhì)內(nèi)的蘋果酸等二羧酸透過(guò)線粒體細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體內(nèi)，進(jìn)而促進(jìn)檸檬酸的轉(zhuǎn)出，為細(xì)胞油脂合成起到促進(jìn)作用，因此二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)于微生物油脂合成與積累具有重要作用。本專利利用卷枝毛霉作為研究微生物產(chǎn)脂的細(xì)胞工廠的模式菌株，利用同源重組的基因工程方法來(lái)提高卷枝毛霉油脂產(chǎn)量，為大力推廣卷枝毛霉的工業(yè)化應(yīng)用提供指導(dǎo)，并且能夠用微生物油脂提供高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的多不飽和脂肪酸，符合人民對(duì)身體健康和高質(zhì)量生活的日益增長(zhǎng)的要求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種卷枝毛霉重組菌株Mu-Dit，包括二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（dit）基因在卷枝毛霉基因組上的整合并過(guò)量表達(dá)，與對(duì)照菌Mc1552相比生成的胞內(nèi)油脂產(chǎn)量提高了33.76%，胞內(nèi)油脂含量可以達(dá)到總脂肪酸的17.67 %。