[發(fā)明專利]一種含有ApcE2突變體的融合蛋白及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811399622.0
• 申請日: 2018-11-22
• 公開（公告）號: CN109553689B
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周明;夏坤;付衛(wèi)雷;吳明;陳彥蓉
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué);廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;G01N21/64;G01N33/68;G01N33/58
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強(qiáng)

本發(fā)明公開了一種融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列為：F1多肽—連接保護(hù)肽1—F2多肽—連接保護(hù)肽2—F1多肽，其中F1多肽為序列為SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中的任意一種，F(xiàn)2多肽序列為SEQ ID No.3～SEQ ID No.14中的任意一種。本發(fā)明中通過將ApcE2突變體與經(jīng)過基因工程改造的別藻藍(lán)蛋白亞基BDFP1.1或BDFP1.2進(jìn)行融合得到一種融合蛋白，提高了ApcE2突變體在哺乳動物細(xì)胞中標(biāo)記的熒光較弱的問題。并且發(fā)現(xiàn)在熒光標(biāo)記過程中體外添加光敏色素PΦB，可有效提高融合蛋白進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記時(shí)的亮度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種含有ApcE2突變體的融合蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展越來越依賴光學(xué)技術(shù)，例如熒光成像、光學(xué)檢測及光誘導(dǎo)操縱等等。在活體中對深層組織進(jìn)行成像定位，最好選用650nm-900nm波段的熒光。因?yàn)檫@個波段的光自發(fā)熒光較小、光散射小且對組織損傷較小。近年來，作為熒光探針研究較多的兩類蛋白為綠色熒光蛋白家族和細(xì)菌光敏色素蛋白(BphP)。

少數(shù)藍(lán)細(xì)菌為了更適應(yīng)環(huán)境、從環(huán)境中捕獲更多的能量，慢慢進(jìn)化出能利用遠(yuǎn)紅光的藻膽體。這些藻膽體中通常存在不同于傳統(tǒng)的核膜連接蛋白和一到三個別藻藍(lán)蛋白亞基，其熒光發(fā)光機(jī)制類似于細(xì)菌光敏色素蛋白(BphP)，發(fā)色團(tuán)為非共價(jià)結(jié)合的藻藍(lán)膽素PCB。

另有研究，對來自藍(lán)細(xì)菌Chroococcidiopsisthermalissp.PCC7203的別藻藍(lán)蛋白亞基ApcF2進(jìn)行基因工程改造，得到一系列遠(yuǎn)紅光和近紅外光的熒光蛋白，其被命名為BDFP熒光蛋白。其中的BDFP1.1，共價(jià)結(jié)合膽綠素BV后，最大吸收波長為682nm，熒光波長707nm；BDFP1.2，最大吸收波長為642nm，熒光波長668nm。BDFP系列熒光蛋白具有較小的分子量，能與色素共價(jià)結(jié)合，性能穩(wěn)定，耐受極端環(huán)境；可用于對人類細(xì)胞系、線蟲細(xì)胞等活體細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，也適用于標(biāo)記乳酸桿菌、質(zhì)體、線粒體等。

最新的研究發(fā)現(xiàn)，ApcE2(1-273)，來自藍(lán)細(xì)菌Synechococcussp.PCC7335，由S7335_3294編碼，其序列中保守的半胱氨酸被纈氨酸替代，因此與色素是以非共價(jià)方式連接，其光譜均比共價(jià)連接色素的ApcE1紅移近40nm。它與藻紅膽素PEB重組，最大吸收峰在614nm，最大熒光峰在628nm；與藻藍(lán)膽素PCB重組，最大吸收峰在700nm，最大熒光峰在714nm；還可以連接光敏色素PΦB，吸收進(jìn)一步紅移至714nm，熒光在726nm，為目前熒光標(biāo)記所能達(dá)到的最長熒光發(fā)射波長。

由于ApcE2是膜蛋白，需要在含高濃度變性劑(3.5mol/L尿素)的條件下溶解；在室溫下不夠穩(wěn)定，故而會影響標(biāo)記。已有文獻(xiàn)(繆丹.紅移藻膽蛋白和光敏色素的研究及分子進(jìn)化[D].2017.)報(bào)道：對蛋白N端、C端的截短及l(fā)oop環(huán)(77-161)的部分缺失改造，并沒有提高蛋白的可溶性。

申請人在研究中以ApcE2(24-245)為模板進(jìn)行基因改造后，得到的BDFP3等系列蛋白，解決了可溶性問題，結(jié)合光敏色素PΦB后，可以對大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，但是在哺乳動物細(xì)胞中標(biāo)記的熒光較弱。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種含有ApcE2突變體的融合蛋白及其應(yīng)用，解決ApcE2突變體在哺乳動物細(xì)胞中標(biāo)記的熒光較弱的問題。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種融合蛋白，其氨基酸序列為：F1多肽—連接保護(hù)肽1—F2多肽—連接保護(hù)肽2—F1多肽，其中F1多肽為序列為SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中的任意一種，F(xiàn)2多肽序列為SEQ ID No.3～SEQ ID No.14中的任意一種。

進(jìn)一步地，F(xiàn)2多肽序列為SEQ ID No.8～SEQ ID No.13中的任意一種。

進(jìn)一步地，連接保護(hù)肽1的長度為10～20個氨基酸。