[發明專利]重組豬圓環病毒2型Rep蛋白、ELISA檢測試劑盒及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201811394114.3
• 申請日: 2018-11-21
• 公開（公告）號: CN109535229B
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 榮俊;陳清清;李國攀;徐保娟;匡紅艷;郝堯光
• 申請（專利權）人: 長江大學;青島易邦生物工程有限公司
• 主分類號: C07K14/01
• 分類號: C07K14/01;C12N15/34;C12N15/70;C12N1/21;G01N33/569;C12R1/19
• 代理公司: 武漢智嘉聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 42231
• 代理人: 黃君軍

1.一種重組豬圓環病毒2型Rep蛋白，其特征在于，所述的重組豬圓環病毒2型Rep蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一種重組豬圓環病毒2型Rep蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1、構建重組豬圓環病毒2型Rep蛋白基因克隆載體：設計巢式PCR引物對所采集的PCV2野毒感染豬病料進行DNA提取和巢式PCR擴增后構建成PCV2 Rep蛋白基因克隆載體；

步驟2、重組豬圓環病毒2型Rep蛋白基因改造：針對步驟1所得的巢式PCR擴增產物設計引物實現PCV2 Rep蛋白基因表達密碼子的優化；且通過Over lapping PCR的方法，在PCV2Rep蛋白基因表達序列的5’端增加編碼His的序列，并封閉原序列中的NcoⅠ酶切位點；

步驟3、構建重組豬圓環病毒2型Rep蛋白表達質粒載體，所述表達載體表達區的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

步驟4、構建重組豬圓環病毒2型Rep蛋白表達工程菌；

步驟5、重組豬圓環病毒2型Rep蛋白的誘導表達及純化。

3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟1中巢式PCR引物如下：

PCV2 rep巢式PCR外套上游引物PF：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，

PCV2 rep巢式PCR外套下游引物PR：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，

PCV2 rep巢式PCR內套上游引物PF：核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，

PCV2 rep巢式PCR內套下游引物PR：核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述步驟2中密碼子優化所用的引物如下：

密碼子優化上游引物序列：核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

密碼子優化下游引物序列：核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

4.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2中Over lapping PCR包括Over lapping PCR A片段和Over lapping PCR B片段，

Over lapping PCR A片段的擴增模板為密碼子優化后的擴增產物所構建的加載了PCV2 rep基因的pET28a表達質粒，所述A片段的擴增引物為：

A片段的擴增上游引物AP1：核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

A片段的擴增下游引物AP2：核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

Over lapping PCR B片段的擴增模板為密碼子優化后的擴增產物所構建的加載了PCV2 rep基因的pET28a表達質粒，所述B片段的擴增引物為：

B片段的擴增上游引物AP1：核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

B片段的擴增下游引物AP2：核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

Over lapping PCR AB片段的擴增的模板是A片段擴增產物和B片段擴增產物，AB片段擴增引物為：

AB片段擴增上游引物AP1：核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

AB片段擴增下游引物BP2：核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

5.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟5中PCV2 Rep蛋白誘導表達后的純化條件是：上樣緩沖液：8M尿素+0.05M pH7.4PBS；淋洗緩沖液：100mM咪唑+上樣緩沖液；洗脫緩沖液：300mM咪唑+上樣緩沖液。

6.一種豬圓環病毒2型Rep蛋白表達載體，其特征在于，所述表達載體的表達區的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

7.一種豬圓環病毒2型Rep蛋白表達工程菌，其特征在于，該工程菌包含權利要求6所述的豬圓環病毒2型Rep蛋白表達載體。