[發明專利]一種富含多糖類的植物基因組DNA的提取方法

在審

• 申請號: 201811393338.2
• 申請日: 2018-11-21
• 公開（公告）號: CN109439652A
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發明（設計）人: 劉艷艷;馬義峰;張洪波;孫子奎
• 申請（專利權）人: 上海派森諾生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 上海天翔知識產權代理有限公司 31224
• 代理人: 呂伴

本發明公開了一種富含多糖類的植物基因組DNA的提取方法，包括如下步驟：使用液氮研磨；加入預冷的CTAB?free buffer，巰基乙醇，充分震蕩混勻；放置冰上，控制溫度在4℃，離心，棄掉上清；根據粘稠度再用PBS清洗一次，加入SDS溶液，巰基乙醇，混勻；然后水浴，期間顛倒混勻；待冷卻后，加入等體積苯酚：氯仿，上下顛倒混勻；離心n，取上清，加入RNase A，上下顛倒混勻，室溫放置；加入異丙醇，顛倒混勻，室溫放置或者低溫放置，離心，棄上清，使用75％乙醇清洗，加入適量體積的滅菌水溶解。本發明的方法對于富有多糖類的植物基因具有更好的提取效果，在基因完整性及后續的純度來說都比常規的方法提取更好。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種富含多糖類的植物基因組DNA 的提取方法。

背景技術

近年來，由于分子生物學技術和測序技術的發展為科研工作者研究微生物基因組序列、次級代謝產物的合成機理等提供了良好的基礎，而植物DNA的獲得則是這些工作的基礎。

多糖作為植物細胞的結構組成物質和營養儲存物質在植物細胞中大量存在。多糖是干擾植物DNA提取的主要物質。多糖的許多理化性質與DNA很相似，因此很難將他們分離。多糖與DNA的結合形成的膠狀物質不但影響實驗的操作而且通過引起酶的活性中心改變或必須基團的改變而抑制許多酶的活性，嚴重影響分子生物學研究的下游工作。

隨著測序技術的高速發展，Pacific Bioscience的SMRT技術引起科研人員的廣泛關注。該測序也是基于邊合成邊測序的原理，該項技術使用了 Zero-Mode Wave guide(ZMW)(零級波導)。測序的過程：被熒光標記磷酸集團的核苷酸在聚合酶活性位點上與模板鏈結合(每種脫氧核苷酸被不用顏色的染料標記)，被激發出熒光，在熒光脈沖結束后，被標記的磷酸集團被切割并釋放，聚合酶轉移到下一個位置，下一個脫氧核苷酸連接到位點上開始釋放熒光脈沖，進行下一個循環。該技術對DNA的質量和純度要求特別高，如DNA 降解則造成數據量少，數據質量差，拼接效果不理想；DNA純度不高，有糖或者鹽類等物質污染會造成聚合酶活性降低甚至失活，造成實驗成本的浪費。

以往針對多糖類植物的基因組提取，只能使用試劑盒提取，但試劑盒昂貴，經過過柱也會有不同程度的打斷，造成DNA不完整。本實驗方法簡單易于操作，耗時短，成本較低，條帶完整，能干凈的去除多糖等雜質污染，適用于多種富含多糖類植物基因組的提取。

發明內容

為了克服現有技術存在的上述缺陷，本發明的目的在于提供一種DNA提取純度高，完整性好的富含多糖類的植物基因組DNA的提取方法。

為了實現上述發明的目的，所采用的技術方案是：

一種富含多糖類的植物基因組DNA的提取方法，包括如下步驟：

使用液氮在55-65Hz的范圍下研磨30-300S；

加入1ml預冷的CTAB-free buffer，20ul巰基乙醇，充分震蕩混勻；

放置冰上2-3min，控制溫度在4℃，以2000-5000rpm的速度，離心5-20 分鐘，棄掉上清；

使用PBS溶液進行清洗去除多糖類雜質；所使用的PBS溶液為1XPBS溶液：即10XPBS溶液(Ambion，500ml/10X PBS buffer PH 7.4,貨號:AM9624)，用無菌水稀釋10倍即可。

接入65℃預熱的SDS溶液500-1000ul，1％-4％巰基乙醇，混勻；

然后放入65℃水浴中20-60min，期間至少顛倒混勻3次；

待冷卻后，加入等體積苯酚：氯仿，上下顛倒30-40次混勻；