[發(fā)明專(zhuān)利]芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白ARNT——一種新型海洋生物污染檢測(cè)標(biāo)志物

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811390400.2
• 申請(qǐng)日: 2018-11-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109306001A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭寶英;劉碩博;祁鵬志;唐祖蓉;葉瑩瑩
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江海洋大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/435
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/435;C12N15/12;C12N15/10;C12Q1/6888
• 代理公司: 杭州浙科專(zhuān)利事務(wù)所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

1.芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白ARNT，其特征在于：其氨基酸序列為SEQ ID NO.2。

2.一種基因，其特征在于，所述的基因編碼權(quán)利要求1所述的芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白。

3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.1。

4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白ARNT的克隆方法，包括：準(zhǔn)備樣品、提取總RNA、合成cDNA第一鏈、克隆核心序列、PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析、生物信息學(xué)分析，其特征在于：所述芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白ARNT克隆核心序列中PCR擴(kuò)增的簡(jiǎn)并引物為：

ARNT 01F：5′-TGTACCGGGCCCATCAAAGCTTGGCC-3′和

ARNT 02R：5′-CACGTCTGACTAAGGAGGCTGAAA-3′。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白ARNT的克隆方法，其特征在于包括以下步驟：

準(zhǔn)備樣品：取健康均勻的厚殼貽貝在溫度20～25℃，pH值8.0條件下飼養(yǎng)；

提取總RNA：以厚殼貽貝作為材料，提取各組織總RNA；

合成cDNA第一鏈：以獲得的總RNA樣品作為模板，oligo(dT)₂₀為反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄合成，獲得cDNA第一鏈；

克隆核心序列：使用簡(jiǎn)并引物ARNT 01F和ARNT 02R，以上述cDNA為模板，用Taq DNA聚合酶(TaKaRa)PCR擴(kuò)增出核心序列；

克隆全長(zhǎng)序列：分別設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增3′RACE和5′RACE未知片段，將3′端、5′端和核心片段序列進(jìn)行拼接；

PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析：PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳純化、回收后克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coil DH5α，利用M13正反向引物，通過(guò)PCR反應(yīng)得到陽(yáng)性克隆，送檢測(cè)序并分析；

生物信息學(xué)分析：芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白ARNT cDNA片段大小為2043bp，共編碼681個(gè)氨基酸。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白ARNT的克隆方法，其特征在于：所述克隆核心序列中的PCR反應(yīng)體系總體積25.0μl，其中ddH₂O 15.5μl、10×PCR buffer 2.5μl、20mM MgCl₂ 2.5μl、2.5mM dNTP 1.0μl、10μM引物各1.0μl、cDNA 1.0μl、rTaq酶0.5μl。

7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白ARNT的克隆方法，其特征在于：所述克隆核心序列中的PCR反應(yīng)的程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min，94℃1min，40℃1min，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。

8.一種利用權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白ARNT用作新型海洋生物污染檢測(cè)標(biāo)記物，其特征在于：以厚殼貽貝作為檢測(cè)海洋污染的生物樣本，以厚殼貽貝芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白ARNT用作海洋污染的檢測(cè)標(biāo)記物。

9.如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白ARNT用作新型海洋生物污染檢測(cè)標(biāo)記物在海洋污染檢測(cè)中的應(yīng)用。

10.一種利用權(quán)利要求8或9所述的新型海洋生物污染檢測(cè)標(biāo)記物檢測(cè)海洋生物污染的方法，其特征在于包括：通過(guò)對(duì)受到污染區(qū)域厚殼貽貝的解剖提取消化腺和腮中的RNA，反轉(zhuǎn)錄成DNA，再利用熒光定量技術(shù)檢測(cè)芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白ARNT在消化腺和腮中的相對(duì)表達(dá)量，即可。