[發(fā)明專利]一種化學(xué)交聯(lián)劑及其制備和應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201811390003.5
• 申請日: 2018-11-21
• 公開（公告）號: CN111205213A
• 公開（公告）日: 2020-05-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張麗華;高航;趙群;安雨馨;張玉奎
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號: C07D207/404
• 分類號: C07D207/404;C07D495/04;G01N33/68
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種化學(xué)交聯(lián)劑，其特征在于：同時(shí)具有氨基酸骨架、同位素標(biāo)記以及富集功能基團(tuán)，其結(jié)構(gòu)式為：

其中，n取值范圍為1-5，對應(yīng)不同碳鏈長度的氨基酸骨架；氨基酸骨架引入同位素標(biāo)記，包括氘、碳13或氮15中的一種或兩種以上；R為化學(xué)富集基團(tuán)，包括炔基、疊氮或生物素中的一種。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)交聯(lián)劑，其特征在于：

以不同碳鏈長度的氨基酸為骨架結(jié)構(gòu)，包括兩種天然氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；三種非天然氨基酸：2-氨基-1,6-己二酸、2-氨基-1,7-庚二酸、2-氨基-1,8-辛二酸；氨基酸骨架引入同位素標(biāo)記，包括氘、碳13或氮15中的一種或兩種以上，實(shí)現(xiàn)化學(xué)交聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)與蛋白組學(xué)定量技術(shù)結(jié)合，獲取細(xì)胞內(nèi)蛋白的時(shí)空動態(tài)變化信息；化學(xué)交聯(lián)劑具有兩個(gè)琥珀酰亞胺酯結(jié)構(gòu)單元，高效溫和地與蛋白質(zhì)、多肽賴氨酸末端或N端氨基發(fā)生反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的快速交聯(lián)；化學(xué)交聯(lián)劑具有化學(xué)富集基團(tuán)，包括炔基、疊氮或生物素中的一種，通過富集方式提高交聯(lián)肽在質(zhì)譜中的響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)交聯(lián)肽高通量、高靈敏度分析；化學(xué)交聯(lián)劑具有電中性、疏水結(jié)構(gòu)，交聯(lián)劑穿過細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞質(zhì)及各個(gè)亞細(xì)胞器，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)蛋白原位化學(xué)交聯(lián)，獲取高可信度的蛋白三維結(jié)構(gòu)以及蛋白-蛋白相互作用信息。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)交聯(lián)劑的制備方法，其特征在于，具體過程如下：

(1)

(2)

(3)

步驟一，具有富集基團(tuán)R的羧酸為起始原料，乙二酰氯為酰化試劑，N,N-二甲基甲酰胺，以下簡稱DMF，為催化劑，無水二氯甲烷為反應(yīng)溶劑，制備富集基團(tuán)酰氯試劑；

步驟二，以1-5不同碳鏈長度或同位素標(biāo)記的氨基酸為原料，在飽和碳酸氫鈉溶液中，與步驟一新制備的富集基團(tuán)酰氯發(fā)生酰胺化反應(yīng)，濃鹽酸調(diào)反應(yīng)液為酸性，制備修飾富集基團(tuán)的二羧酸化合物；

步驟三，以步驟二制備的修飾富集基團(tuán)的二羧酸化合物為原料，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，以下簡稱EDCI，為縮合劑，與N-羥基琥珀酰亞胺，以下簡稱NHS，發(fā)生酯化反應(yīng)，即制得不同碳鏈長度氨基酸骨架同位素標(biāo)記富集型化學(xué)交聯(lián)劑。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化學(xué)交聯(lián)劑的制備方法，其特征在于：步驟一中將具有富集基團(tuán)的羧酸溶于無水二氯甲烷中，加入0.01-0.1mL DMF，反應(yīng)液降溫至0-5℃，取乙二酰氯滴加至反應(yīng)液，乙二酰氯與富集基團(tuán)的羧酸摩爾比控制在1：1至1.5：1，滴畢，反應(yīng)液升溫至15-25℃，繼續(xù)反應(yīng)1-2h，即制得具有富集基團(tuán)的酰氯試劑。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化學(xué)交聯(lián)劑的制備方法，其特征在于：步驟二中將不同碳鏈長度或同位素標(biāo)記的氨基酸溶于飽和的碳酸氫鈉中，氨基酸與碳酸氫鈉摩爾比控制在1：3至1：5，反應(yīng)液降溫至0-5℃，滴加步驟一新制備的具有富集基團(tuán)的酰氯試劑，氨基酸與具有富集基團(tuán)的酰氯試劑摩爾比控制在1：1.1至1：1.3，滴畢，反應(yīng)液升溫至15-25℃，繼續(xù)反應(yīng)1-2h，反應(yīng)畢，飽和氫氧化鈉溶液調(diào)反應(yīng)液pH為10-12，用乙酸乙酯洗水相，洗畢，濃鹽酸調(diào)反應(yīng)液pH為1-3，用乙酸乙酯萃取水相，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑，粗產(chǎn)物二氯甲烷重結(jié)晶，即制得修飾富集基團(tuán)的二羧酸化合物。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化學(xué)交聯(lián)劑的制備方法，其特征在于：步驟三中將修飾富集基團(tuán)的二羧酸化合物、EDCI與NHS置于無水二氯甲烷中，三者的摩爾比控制在1：2.2：2.2至1：3.0：3.0，20-25℃攪拌12-24h，反應(yīng)畢，減壓蒸干有機(jī)溶劑，將粗產(chǎn)物溶于二甲基亞砜，以下簡稱DMSO，以水、乙腈為流動相，碳十八硅球?yàn)樘盍希冒胫苽浞聪嗌V分離純化即制得不同碳鏈長度氨基酸骨架具有同位素標(biāo)記富集型的化學(xué)交聯(lián)劑。

7.權(quán)利要求1所述的化學(xué)交聯(lián)劑的應(yīng)用，特點(diǎn)在于：細(xì)胞內(nèi)原位蛋白復(fù)合體的規(guī)模化分析、細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞器蛋白質(zhì)復(fù)合物規(guī)模化分析、細(xì)胞內(nèi)原位目標(biāo)蛋白質(zhì)復(fù)合物分析、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)解析、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用解析或蛋白質(zhì)時(shí)空動態(tài)變化分析過程中。