[發明專利]一種化學交聯劑及其制備和應用

在審

• 申請號: 201811390003.5
• 申請日: 2018-11-21
• 公開（公告）號: CN111205213A
• 公開（公告）日: 2020-05-29
• 發明（設計）人: 張麗華;高航;趙群;安雨馨;張玉奎
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C07D207/404
• 分類號: C07D207/404;C07D495/04;G01N33/68
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種化學交聯劑，其特征在于：同時具有氨基酸骨架、同位素標記以及富集功能基團，其結構式為：

其中，n取值范圍為1-5，對應不同碳鏈長度的氨基酸骨架；氨基酸骨架引入同位素標記，包括氘、碳13或氮15中的一種或兩種以上；R為化學富集基團，包括炔基、疊氮或生物素中的一種。

2.根據權利要求1所述的化學交聯劑，其特征在于：

以不同碳鏈長度的氨基酸為骨架結構，包括兩種天然氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；三種非天然氨基酸：2-氨基-1,6-己二酸、2-氨基-1,7-庚二酸、2-氨基-1,8-辛二酸；氨基酸骨架引入同位素標記，包括氘、碳13或氮15中的一種或兩種以上，實現化學交聯質譜技術與蛋白組學定量技術結合，獲取細胞內蛋白的時空動態變化信息；化學交聯劑具有兩個琥珀酰亞胺酯結構單元，高效溫和地與蛋白質、多肽賴氨酸末端或N端氨基發生反應，實現蛋白質的快速交聯；化學交聯劑具有化學富集基團，包括炔基、疊氮或生物素中的一種，通過富集方式提高交聯肽在質譜中的響應，實現交聯肽高通量、高靈敏度分析；化學交聯劑具有電中性、疏水結構，交聯劑穿過細胞膜到達細胞質及各個亞細胞器，實現細胞內蛋白原位化學交聯，獲取高可信度的蛋白三維結構以及蛋白-蛋白相互作用信息。

3.根據權利要求1所述的化學交聯劑的制備方法，其特征在于，具體過程如下：

(1)

(2)

(3)

步驟一，具有富集基團R的羧酸為起始原料，乙二酰氯為酰化試劑，N,N-二甲基甲酰胺，以下簡稱DMF，為催化劑，無水二氯甲烷為反應溶劑，制備富集基團酰氯試劑；

步驟二，以1-5不同碳鏈長度或同位素標記的氨基酸為原料，在飽和碳酸氫鈉溶液中，與步驟一新制備的富集基團酰氯發生酰胺化反應，濃鹽酸調反應液為酸性，制備修飾富集基團的二羧酸化合物；

步驟三，以步驟二制備的修飾富集基團的二羧酸化合物為原料，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，以下簡稱EDCI，為縮合劑，與N-羥基琥珀酰亞胺，以下簡稱NHS，發生酯化反應，即制得不同碳鏈長度氨基酸骨架同位素標記富集型化學交聯劑。

4.根據權利要求3所述的化學交聯劑的制備方法，其特征在于：步驟一中將具有富集基團的羧酸溶于無水二氯甲烷中，加入0.01-0.1mL DMF，反應液降溫至0-5℃，取乙二酰氯滴加至反應液，乙二酰氯與富集基團的羧酸摩爾比控制在1：1至1.5：1，滴畢，反應液升溫至15-25℃，繼續反應1-2h，即制得具有富集基團的酰氯試劑。

5.根據權利要求3所述的化學交聯劑的制備方法，其特征在于：步驟二中將不同碳鏈長度或同位素標記的氨基酸溶于飽和的碳酸氫鈉中，氨基酸與碳酸氫鈉摩爾比控制在1：3至1：5，反應液降溫至0-5℃，滴加步驟一新制備的具有富集基團的酰氯試劑，氨基酸與具有富集基團的酰氯試劑摩爾比控制在1：1.1至1：1.3，滴畢，反應液升溫至15-25℃，繼續反應1-2h，反應畢，飽和氫氧化鈉溶液調反應液pH為10-12，用乙酸乙酯洗水相，洗畢，濃鹽酸調反應液pH為1-3，用乙酸乙酯萃取水相，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑，粗產物二氯甲烷重結晶，即制得修飾富集基團的二羧酸化合物。

6.根據權利要求3所述的化學交聯劑的制備方法，其特征在于：步驟三中將修飾富集基團的二羧酸化合物、EDCI與NHS置于無水二氯甲烷中，三者的摩爾比控制在1：2.2：2.2至1：3.0：3.0，20-25℃攪拌12-24h，反應畢，減壓蒸干有機溶劑，將粗產物溶于二甲基亞砜，以下簡稱DMSO，以水、乙腈為流動相，碳十八硅球為填料，利用半制備反相色譜分離純化即制得不同碳鏈長度氨基酸骨架具有同位素標記富集型的化學交聯劑。

7.權利要求1所述的化學交聯劑的應用，特點在于：細胞內原位蛋白復合體的規模化分析、細胞內亞細胞器蛋白質復合物規模化分析、細胞內原位目標蛋白質復合物分析、蛋白質的空間結構解析、蛋白質-蛋白質相互作用解析或蛋白質時空動態變化分析過程中。