[發明專利]檢測基因突變的引物、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201811386433.X
• 申請日: 2018-11-20
• 公開（公告）號: CN109628589A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發明（設計）人: 孫培
• 申請（專利權）人: 北京昱晟達醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 路秀麗;張永明

本發明提供了一種檢測基因突變的引物、試劑盒及方法。該引物包括上游引物和下游引物，上游引物包括依次相連的通用擴增序列、熒光探針序列以及目的片段上游特異性擴增序列；下游引物包括目的片段的下游特異性擴增序列；目的片段上游特異性擴增序列是區分野生型目的片段與突變型目的片段的特異性擴增序列。將探針設計在目的片段特異性擴增序列的上游，使得目的片段長度可以按需縮短，提高了對血漿cfDNA類樣本的利用率和臨床應用價值。而在熒光探針序列的上游同時設置通用擴增序列，不僅方便后續擴增，減少整體引物的用量，進而避免整體引物所需用量太大而導致的擴增特異性降低，而且通用擴增序列的存在還有助提高該引物使用的通用性。

技術領域

本發明基因檢測領域，具體而言，涉及一種檢測基因突變的引物、試劑盒及方法。

背景技術

目前，檢測基因的樣本可以是新鮮的組織樣本、石蠟包埋的組織樣本或者是血漿樣本，比如血漿中的游離碎片DNA(cfDNA)。而常用的檢測基因突變的方法有高通量測序法和ARMS-PCR法。這兩種方法在檢測200bp以上的目的片段時比較有優勢，但在檢測小于200bp的較短片段，比如在檢測DNA片段長度主要是166bp左右的血漿樣本時，都存在各自的缺點。

其中，高通量測序法的缺點是檢測時間比較長，操作比較繁瑣，而且高通量測序法由于受建庫連接效率的影響，目前市面上最好的建庫試劑盒文庫的連接轉化率也僅在20-30％之間，照此計算，對血漿cfDNA這類小于200bp的片段而言，大于70％的DNA片段不能被高通量測序法所利用。比如，cSMART技術，建庫損失大部分血漿cfDNA片段，成環又只有不到20％文庫能被環化作為后期擴增的模板，所以這種方法前后要擴增40-50個循環，檢測的真實性存疑，實驗可重復性很差。

而傳統的ARMS-PCR法，其最初主要是針對非血漿樣本設計的，上下游引物與中間Taqman探針加在一起至少100bp以上，本來血漿的cfDNA片段長度主要是166bp左右，所以傳統ARMS-PCR對血漿cfDNA片段的利用率也不高。若擴增片段接近200bp，則很少的DNA片段能被利用。

因而，針對像血漿cfDNA片段大小的樣本進行基因突變檢測時，上述兩種方法都未考慮DNA片段的利用率，而僅片面強調檢測的靈敏度和準確性，這樣的檢測是不可靠的。尤其是利用血漿cfDNA檢測與疾病(如腫瘤)相關的位點時，可靠性則更低，臨床應用價值受限。

因此，仍需要對現有的檢測手段進行改進，以提供一種適用于針對像血漿cfDNA片段大小的一類樣本的基因突變檢測。

發明內容

本發明的主要目的在于提供一種檢測基因突變的引物、試劑盒及方法，以適用于對血漿cfDNA類樣本的突變檢測。

為了實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種檢測基因突變的引物，該引物包括上游引物和下游引物，上游引物包括依次相連的通用擴增序列、熒光探針序列以及目的片段上游特異性擴增序列；下游引物包括目的片段的下游特異性擴增序列；其中，目的片段上游特異性擴增序列是區分野生型目的片段與突變型目的片段的特異性擴增序列。

進一步地，熒光探針序列為通用熒光探針序列。

進一步地，目的片段上游特異性擴增序列與野生型目的片段之間存在至少兩個錯配堿基，且其中一個錯配堿基即為目的片段上游特異性擴增序列的3’末端堿基，記作最末端錯配堿基。

進一步地，最末端錯配堿基的錯配類型屬于以下任意一種：A-A、G-G、C-C、A-G及G-A，與最末端錯配堿基相鄰的倒數第二位堿基為錯配堿基，記作末端第二錯配堿基；優選地，末端第二錯配堿基為與野生型目的片段上對應的堿基相同的堿基，或者為與突變型目的片段上對應的堿基相同的堿基。