[發明專利]基于CRISPR-Cas9靶向基因組修飾技術構建Egr2-Luciferase-KI-HEK293細胞系方法

在審

• 申請號: 201811383456.5
• 申請日: 2018-11-20
• 公開（公告）號: CN109797166A
• 公開（公告）日: 2019-05-24
• 發明（設計）人: 夏海濱;曹坤坤
• 申請（專利權）人: 陜西師范大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/12;C12N5/10
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 李鄭建

1.一種基于CRISPR-Cas9靶向基因組修飾技術構建Egr2-Luciferase-KI-HEK293細胞系的方法，其特征在于，將靶向Egr2基因的打靶載體與打靶供體共轉HEK293細胞系，使攜帶熒光素酶報告基因的打靶載體在Egr2基因組下游目標位點處正確重組，重組基因受內源性Egr2基因啟動子的調控，獲得單一穩定的Egr2-Luciferase-KI-HEK293細胞系，并驗證Egr2-Luciferase-KI-HEK293細胞系中Luciferase表達變化是否可以真實反映內源性Egr2基因的相對表達量及表達變化。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，具體按下列步驟實施：

(1)靶向Egr2基因3′非編碼區的sgRNA的設計、構建sgRNA打靶載體及活性檢測：

在NCBI上查找Egr2基因的基因組序列，在其終止密碼子下游選擇四個sgRNA結合位點并設計合成相應的sgRNA引物，將sgRNA引物退火后連入pU6-sgRNA1.0，與攜帶Cas9的表達載體共轉染HEK293細胞，轉染72小時后，提取基因組DNA，對打靶區域進行PCR擴增，并利用T7E1法篩選最高切割活性的sgRNA；

(2)構建攜帶Cas9、sgRNA表達元件的真核表達載體：

將篩選獲得的靶向Egr2基因的sgRNA表達元件、Cas9表達元件依次連入真核表達載體獲得pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA片段；

(3)構建靶向Egr2基因的打靶供體pUC19/Egr2-donor：

以人源化細胞基因組為模板，PCR擴增上、下游同源臂，依次連入攜帶T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA元件的表達載體的兩端；

(4)Egr2-Luciferase細胞系的建立：

將pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA片段與pUC19/Egr2-donor共轉HEK293細胞系，待細胞系穩定后，加1.0mg/mL的G418篩選10天，待細胞系穩定后，再加10μg/mL的GCV篩選3周左右，待細胞系穩定過后，對細胞經有限稀釋法進行克隆化，再對克隆化后的細胞進行PCR鑒定并測序，證實攜帶熒光素酶報告基因的打靶供體在目標位點處正確重組，最終獲得單一穩定Egr2-Luciferase-KI-HEK293細胞系；

(5)克隆并構建Egr2基因的轉錄激活因子表達載體：

轉錄激活因子表達載體pUC19/CMV-AREB6，用于Egr2基因的轉錄激活實驗研究；

(6)驗證Egr2-Luciferase-KI-HEK293細胞系中Luciferase表達變化是否可以真實反映內源性Egr2基因的相對表達量及表達變化：

使用所構建的Egr2基因的轉錄激活因子AREB6表達載體pUC19/CMV-AREB6分別轉染Egr2-Luciferase-KI-HEK293細胞系和野生型HEK293細胞系，并對Egr2-Luciferase-KI-HEK293細胞系中的Luciferase活性及HEK293細胞系中Egr2分子的mRNA表達水平分別進行檢測；通過對knock-in細胞系中Luciferase表達活性與HEK293細胞中的Egr2mRNA表達水平及變化的比較，進一步驗證Egr2-Luciferase-KI-HEK293細胞系中的Luciferase活性是否可以準確反映Egr2分子的相對表達變化。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的打靶載體攜帶pCMV-Cas9-SV40pA-U6-sgRNAs-SV40pA片段，既含有核酸酶Cas9表達框也含有靶向Egr2的打靶效率高的sgRNA表達組件。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶向Egr2基因的打靶供體攜帶外源片段cDNA，包括T2A-Luciferase-CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA片段，及其兩端與斷裂位點上下游分別具有相同序列的上、下游同源臂，該上、下游同源臂是長度約為1000bp的DNA片段。