[發(fā)明專利]用漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生HPV18 L1蛋白的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811381504.7
• 申請(qǐng)日: 2012-01-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109321592A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李鼎鋒;于躍;霍燭;王貽杰;劉娟;程海;陳丹;劉勇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京安百勝生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/81
• 分類號(hào): C12N15/81;C12N1/19;C07K14/025;C12P21/02;C12N15/37;A61K39/12;A61P31/20;C12R1/78
• 代理公司: 北京永新同創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11376
• 代理人: 程大軍;欒星明

1.一種產(chǎn)生表達(dá)人乳頭瘤病毒18型L1(HPV18 L1)蛋白的重組漢遜酵母細(xì)胞的方法，其包含以下步驟：

a)通過(guò)將包含與MOX啟動(dòng)子和MOX終止子可操縱地連接的編碼HPV18 L1蛋白的核苷酸序列的外源多核苷酸插入序列示于SEQ ID NO：6的載體來(lái)構(gòu)建表達(dá)構(gòu)建體；

b)用步驟a)中獲得的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化漢遜酵母細(xì)胞；和

c)用Zeocin和G418對(duì)步驟b)中獲得的漢遜酵母細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲得含有所述外源多核苷酸的重組漢遜酵母細(xì)胞。

2.權(quán)利要求1的方法，其中所述HPV18 L1蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO：1。

3.權(quán)利要求2的方法，其中所述編碼HPV18 L1蛋白的核苷酸序列示于SEQ ID NO：5。

4.權(quán)利要求1的方法，其中步驟b)中通過(guò)電穿孔來(lái)轉(zhuǎn)化漢遜酵母細(xì)胞。

5.權(quán)利要求1的方法，其中步驟b)中的所述漢遜酵母細(xì)胞是ATCC26012漢遜酵母細(xì)胞。

6.權(quán)利要求1的方法，其中步驟c)中用0.25mg/ml的Zeocin和10mg/ml的G418對(duì)步驟b)中獲得的漢遜酵母細(xì)胞進(jìn)行篩選。

7.權(quán)利要求1的方法，其中步驟c)中所述篩選包括

c1)將步驟b)中獲得的漢遜酵母細(xì)胞涂布于含0.25mg/ml Zeocin的YPD平板中，于37℃倒置培養(yǎng)3-5天；

c2)挑取于含0.25mg/ml Zeocin的YPD平板上長(zhǎng)出的單菌落，接種于5ml含0.25mg/mlZeocin的YPD液體培養(yǎng)基中，于37℃、200rpm搖床培養(yǎng)24-36小時(shí)，至OD值達(dá)50后，以1∶1000的比例轉(zhuǎn)接于5ml含0.25mg/ml Zeocin的YPD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD值達(dá)50后，再以1∶1000的比例轉(zhuǎn)接于5ml含0.25mg/ml Zeocin的YPD液體培養(yǎng)基中，連續(xù)傳10次；

c3)將傳至10次的重組漢遜酵母表達(dá)菌株接入5ml不含Zeocin抗性的YPD液體培養(yǎng)基中，于37℃、200rpm搖床培養(yǎng)至OD值達(dá)50后，以1∶1000的比例轉(zhuǎn)接于5ml YPD液體培養(yǎng)基中，在不含Zeocin抗性的YPD液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳5次；和

c4)將獲得的產(chǎn)物涂布在含10mg/ml G418的YPD平板，于32℃倒置培養(yǎng)2-3天，挑取生長(zhǎng)旺盛的單菌落進(jìn)行拷貝數(shù)檢測(cè)。

8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述重組漢遜酵母細(xì)胞含有多拷貝的所述外源多核苷酸。

9.權(quán)利要求8的方法，其中所述重組漢遜酵母細(xì)胞含有拷貝數(shù)大于30的所述外源多核苷酸。

10.一種根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的重組漢遜酵母細(xì)胞。

11.一種產(chǎn)生HPV18 L1蛋白的方法，包括以下步驟：

i)在適于所述HPV18 L1蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求10的重組漢遜酵母細(xì)胞；

ii)從培養(yǎng)物中回收并純化所述HPV18 L1蛋白。

12.權(quán)利要求11的方法，其還包括對(duì)所純化的HPV18 L1蛋白進(jìn)行解聚和重聚的步驟。

13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的方法產(chǎn)生的HPV18 L1蛋白在制備用于預(yù)防HPV18感染的疫苗中的用途。

14.編碼HPV18 L1蛋白的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

15.一種表達(dá)構(gòu)建體，其通過(guò)將編碼HPV18 L1蛋白的核苷酸序列插入至序列示于SEQID NO：6的表達(dá)載體pRMHP2.1中獲得。

16.一種表達(dá)載體，其包含SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。