[發明專利]人工優化的雙亞基苯酚羥化酶基因及其應用

在審

• 申請號: 201811370519.3
• 申請日: 2018-11-17
• 公開（公告）號: CN109468331A
• 公開（公告）日: 2019-03-15
• 發明（設計）人: 王波;姚泉洪;彭日荷;田永生;高建杰;付曉燕;許晶;李振軍;韓紅娟;王麗娟;朱彥滿;張福建;黃悠楠
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
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本發明公開了一種優化后適用于大腸桿菌表達的苯酚羥化酶基因序列及其應用。編碼的苯酚羥化酶由兩個亞基組成，每個亞基都由獨立的T7啟動子和終止子控制，其核苷酸序列分別如SEQ ID No 1和SEQ ID No 2所示，其編碼的蛋白質的氨基酸序列分別如SEQ ID No 3和SEQ ID No 4所示。本發明優化合成的基因能夠在大腸桿菌中成功表達，可用于制備降解苯酚的微生物。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及結構優化的苯酚羥化酶基因序列。

技術背景

苯酚是一種用途廣泛的重要有機化工原料。它主要用于生產酚醛樹脂、雙酚A、己內酰胺、己二酸、苯胺、烷基酚以及水楊酸等，此外，還可用作溶劑、試劑和消毒劑等，在合成纖維、合成橡膠、塑料、醫藥、農藥、香料、染料以及涂料等方面有廣泛的應用。預計未來幾年，隨著我國環氧樹脂和聚碳酸酯在電子、建材、汽車工業、通訊和計算機等領域消費量的不斷增長，我國苯酚的需求量仍將穩步提高。

隨著苯酚的大量生產和消費，苯酚不可避免的會通過各種途徑污染地下水、地表水和土壤。苯酚對人、動物和農作物都有嚴重的危害。我國政府將其列入68種優先污染物名單并且明確規定飲用水中苯酚含量不得超過0.002mg/l。

微生物由于具有極強的變異性和適應性，是自然環境中降解酚類化合物的主要成員。目前，國內外發現的苯酚降解菌，主要包括細菌和真菌兩大類。其中細菌主要來源于假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)，其次是芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)、產堿菌屬(Alcaligenssp.)和紅球菌屬(Rhodococcus sp.)。

苯酚羥化酶是苯酚降解途徑中的關鍵酶，它將苯酚轉變為芳香族化合物降解的一種核心代謝產物——鄰苯二酚，之后再通過一些相同或相似的核心代謝途徑最終為微生物所利用。苯酚羥化酶主要包括三種類型，單亞基羥化酶、雙亞基羥化酶和多亞基羥化酶。單亞基苯酚羥化酶是一種黃素蛋白單加氧酶，它能夠打斷O₂的O-O鍵，將其中一個氧原子插入苯酚，另一個氧原子則被還原成水。雙亞基或多亞基羥化酶至少都包括兩部分，一部分是寡聚蛋白，負責苯環的羥化，另一部分是單組分鐵硫黃素蛋白，負責將電子從NAD(P)H轉移到加氧酶上。有的羥化酶中還具有調控前兩個組分相互感應的組分。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種能在大腸桿菌的表達的苯酚酚羥化酶基因。不同于Rhodococcus erythropolis野生型苯酚羥化酶基因操縱子表達模式（AJ973228.1），本發明只保留苯酚羥化酶的兩個亞基的編碼序列，并分別連接上獨立的T7啟動子和終止子調控其表達。同時優化編碼區基因結構，遵循以下原則：（一）優化基因密碼子，提高基因翻譯效率。（二）消除基因內部的常用限制性內切酶的識別位點，便于表達盒構建。（三）消除逆向重復序列、莖環結構和轉錄終止信號，使基因內部的GC/AT均衡，提高RNA的穩定性。（四）使基因編碼蛋白符合N端原則，以提高翻譯蛋白的穩定性。（五）優化mRNA二級結構自由能，以提高基因表達效率。值得指出的是，本發明對密碼子的優化同時還兼顧了植物的密碼子偏愛。

所述經優化的苯酚羥化酶亞基pheA1的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。所述經優化的苯酚羥化酶亞基pheA2的核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。每個基因兩端分別邊上T7啟動子與終止子，完整序列兩端分別連接EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點，全長序列由南京金斯瑞公司合成（參見圖1）。

將合成的基因片段經EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，連入相同酶切的載體pET-28a，得到重組質粒pET-PH，并將其轉化大腸桿菌BL21(DE3)，得到陽性株系。