[發(fā)明專利]鄰苯二酚降解相關(guān)四個基因的優(yōu)化重組與應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201811370390.6
• 申請日: 2018-11-17
• 公開（公告）號: CN109517833A
• 公開（公告）日: 2019-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王波;姚泉洪;彭日荷;田永生;高建杰;付曉燕;許晶;李振軍;韓紅娟;王麗娟;朱彥滿;張福建;黃悠楠
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/61;C12N15/53;C12N15/55
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種優(yōu)化后適用于大腸桿菌表達(dá)的鄰苯二酚降解相關(guān)的四個基因及其應(yīng)用。每個基因都由獨(dú)立的T7啟動子和終止子控制，其核苷酸序列分別如SEQ ID No 1、SEQ ID No 2、SEQ ID No 3和SEQ ID No 4所示，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別如SEQ ID No 5、SEQ ID No 6、SEQ ID No 7和SEQ ID No 8所示。本發(fā)明優(yōu)化合成的基因能夠在大腸桿菌中成功表達(dá)，可用于制備降解鄰苯二酚的微生物。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及結(jié)構(gòu)優(yōu)化的鄰苯二酚降解相關(guān)四個基因的序列。

技術(shù)背景

環(huán)境問題是人類當(dāng)前面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。環(huán)境中的有機(jī)污染物種類繁多、性質(zhì)多樣、分布廣泛、對人類和其它生物危害大且難以降解，一直是污染防治中的一個難題。鄰苯二酚，又名兒茶酚，是苯的兩個鄰位氫被羥基取代后形成的化合物，是許多種芳香族化合物如苯、甲苯、萘、苯酚等微生物降解的重要中間體，對動物和人類都有毒害作用，是一種致癌物，其毒性大于苯酚。鄰苯二酚同時也是一種重要的化工產(chǎn)品，常被用于農(nóng)藥合成、人工香料合成、醫(yī)藥合成、阻聚劑、熱穩(wěn)定劑、防腐、照像、化學(xué)分析試劑等。隨著鄰苯二酚使用量的增加，排入環(huán)境中的鄰苯二酚也相應(yīng)增加，所造成的污染也日益嚴(yán)重。

對于環(huán)境中污染物的修復(fù)，包括物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)。物理修復(fù)包括沉淀法、加熱法、萃取法、洗滌法和吸附法等。化學(xué)修復(fù)包括濕式氧化法、光催化氧化法、超臨界水氧化法和聲化學(xué)氧化法等。而與物理和化學(xué)修復(fù)相比，生物修復(fù)具有成本低、處理效果好且無二次污染是極具潛力的污染修復(fù)方法。

Ornston于1966首次在惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）發(fā)現(xiàn)并闡明了鄰苯二酚完全降解的代謝途徑，隨后陸續(xù)在多種土壤細(xì)菌和真菌也中發(fā)現(xiàn)這一途徑。它是由7個基因編碼的6步酶促反應(yīng)，以鄰苯二酚為底物最終將其轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A和琥珀酰輔酶A，進(jìn)入三羧酸循環(huán)而為微生物所利用（參見圖1）。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供能夠在大腸桿菌中表達(dá)的鄰苯二酚降解相關(guān)四個基因：catA基因，編碼鄰苯二酚1,2雙加氧酶；catB基因，編碼粘康酶內(nèi)酯酶；catC基因，編碼粘康酸內(nèi)酯異構(gòu)酶；catD基因，編碼β-酮己二酸內(nèi)酯水解酶。鄰苯二酚經(jīng)過連續(xù)四步酶促反應(yīng)生成β-酮己二酸。基于Rhodococcussp. AN-22菌原始catA、catB、catC和catD基因，本發(fā)明只保留每個基因的編碼序列，并分別連接上獨(dú)立的T7啟動子和終止子調(diào)控其表達(dá)。同時優(yōu)化編碼區(qū)基因結(jié)構(gòu)，遵循以下原則：（一）優(yōu)化基因密碼子，提高基因翻譯效率。（二）消除基因內(nèi)部的常用限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，便于表達(dá)盒構(gòu)建。（三）消除逆向重復(fù)序列、莖環(huán)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄終止信號，使基因內(nèi)部的GC/AT均衡，提高RNA的穩(wěn)定性。（四）使基因編碼蛋白符合N端原則，以提高翻譯蛋白的穩(wěn)定性。（五）優(yōu)化mRNA二級結(jié)構(gòu)自由能，以提高基因表達(dá)效率。值得指出的是，本發(fā)明對密碼子的優(yōu)化同時還兼顧了植物的密碼子偏愛。

所述經(jīng)優(yōu)化的鄰苯二酚降解相關(guān)四個基因的核苷酸序列如SEQ ID No 1、SEQ IDNo 2、SEQ ID No 3和SEQ ID No 4所示。每個基因兩端分別邊上T7啟動子與終止子，完整序列兩端分別連接EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，全長序列由南京金斯瑞公司合成（參見圖2）。

將合成的基因片段經(jīng)EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，連入相同酶切的載體pET-28a，得到重組質(zhì)粒pET-CAT，并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，得到陽性株系。

陽性菌株在100毫升M9(含1%甘油和50μg/ml卡那霉素)液體培養(yǎng)中37℃搖菌24小時，離心去上清，菌體用10毫升M9(含1%甘油、0.2%阿拉伯糖、50μg/ml卡那霉素和1mM IPTG)液體培養(yǎng)基重懸，向其中添加不同濃度的鄰苯二酚，結(jié)果證明陽性菌株能夠有效去除培養(yǎng)基中的鄰苯二酚。