[發明專利]3-氨基-4-羥基苯胂酸乙酰基轉移酶基因EnhoA2及其編碼蛋白與應用

有效

• 申請號: 201811366200.3
• 申請日: 2018-11-16
• 公開（公告）號: CN109504691B
• 公開（公告）日: 2022-01-07
• 發明（設計）人: 趙方杰;黃科;高帆
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/10;C12N15/11;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/02;C12R1/19
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

本發明屬于生物技術和生物醫藥領域，具體涉及3?氨基?4?羥基苯胂酸乙酰基轉移酶基因EnhoA2及其編碼蛋白與應用。本發明中描述的3?氨基?4?羥基苯胂酸乙酰基轉移酶基因EnhoA2的全長768bp，序列如SEQ ID NO.1所示，EnhoA2編碼的蛋白ENhoA2含255個氨基酸，序列如SEQ ID NO.4所示，EnhoA2及其同源基因可用于構建制備乙酰胂胺的基因工程生物或直接用于乙酰胂胺的酶法制備，EnhoA2基因及其編碼產物的發現在生物技術和生物醫藥領域具有重要的理論和應用價值。

技術領域

本發明屬于生物技術和生物醫藥領域，具體涉及3-氨基-4-羥基苯胂酸乙酰基轉移酶基因EnhoA2及其編碼蛋白與應用。

背景技術

乙酰胂胺(CAS號：97-44-9)，別名阿西太松、乙酰胺胂、醋氨胂，分子式為C₈H₁₀AsNO₅，英文簡寫N-AHPAA，是一種抗阿米巴病藥及抗滴蟲病藥，其復方制劑名為滴維凈，臨床上它通常被用作耐甲硝唑滴蟲病治療的首選藥物。目前，該藥物的生產制備是通過化學合成法來完成的，其中最簡單、直接的合成步驟如下：以3-氨基-4-羥基苯胂酸(英文簡寫3-AHPAA)為原料，將其加入5％的氫氧化鈉溶液中，攪拌使原料全溶，調節反應液pH＝8.0，并加熱至30-35℃，之后在劇烈攪拌下加入乙酐進行反應，待沉淀開始析出后，繼續攪拌1h，于55-60℃下向反應液中加入鹽酸，析出的結晶經過濾和水洗等步驟后即為粗品乙酰胂胺。通過上述描述，我們可以發現化學合成法的操作步驟相對比較繁瑣，且對反應條件及反應設備都有一定的要求，這些都是造成化學合成法實施成本較高的重要原因，另外我們也不能忽略化學合成過程中可能造成的廢渣污染問題。酶學合成法是近些年極力提倡的綠色合成技術的重要組成部分，它不僅在工藝生產上不會對環境產生危害，同時它的運行成本及對反應條件的要求通常低于化學合成法，然而，到目前為止，尚未見有任何關于乙酰胂胺酶學合成的報道。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供可用于酶法制備乙酰胂胺的3-氨基-4-羥基苯胂酸乙酰基轉移酶基因EnhoA2。

本發明的另一目的是提供乙酰基轉移酶基因EnhoA2編碼的乙酰基轉移酶EnhoA2。

本發明的又一目的是提供該基因、蛋白的應用。

本發明的目的可通過以下技術方案實現：

乙酰基轉移酶基因EnhoA2，其核苷酸序列為：SEQ ID NO.1。

本發明中乙酰基轉移酶基因EnhoA2克隆自一株能夠在好氧條件下轉化洛克沙胂的菌株Enterobacter sp.CZ-1。菌株CZ-1保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2018789，保藏日期2018年11月12日。通過前期對代謝產物進行分析鑒定，我們發現菌株CZ-1中存在著一條主要的洛克沙胂生物轉化途徑，即進入該菌體的洛克沙胂首先會被還原轉化為3-氨基-4-羥基苯胂酸，之后又將迅速地轉化為乙酰胂胺，因而我們推測在菌株CZ-1體內應該存在著可以將3-氨基-4-羥基苯胂酸直接轉化為乙酰胂胺的酶類。

克隆3-氨基-4-羥基苯胂酸乙酰基轉移酶采用的方法是常規的異源表達法。從菌株CZ-1的基因組中檢索到33個乙酰基轉移酶編碼基因，將它們分別通過PCR反應擴增出來，擴增產物分別連接到表達載體pET29a(+)上，獲得的重組質粒再分別轉入大腸桿菌【BL21(DE3)】感受態細胞中，通過比較獲得的陽性克隆子對3-氨基-4-羥基苯胂酸的乙酰化能力，我們從上述33個候選基因中鑒定到一個3-氨基-4-羥基苯胂酸乙酰基轉移酶編碼基因ENhoA2，接著我們通過生物化學手段對這個基因的編碼產物ENhoA2的酶學特性進行了詳細的研究。

乙酰基轉移酶基因EnhoA2所編碼的乙酰基轉移酶ENhoA2，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。