[發(fā)明專利]一種發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的復(fù)合培養(yǎng)基

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811364489.5
• 申請日: 2018-11-16
• 公開（公告）號: CN111197039B
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉希軍
• 申請（專利權(quán)）人: 青島科瑞培養(yǎng)基有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N1/20;C12R1/07
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的復(fù)合培養(yǎng)基。所述的培養(yǎng)基成分包括特定分子量殼聚糖、肌醇、生物素、酵母浸粉、葡萄糖、鹽酸硫胺素、核黃素和維生素。本發(fā)明所述的培養(yǎng)基可供芽孢桿菌良好生長，并產(chǎn)生高活力殼聚糖酶。本發(fā)明的培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基相比，殼聚糖酶產(chǎn)量提高2?3倍，產(chǎn)量達到1.5mg/mL，酶活可達300000U/L。該培養(yǎng)基大大降低了殼聚糖酶的生產(chǎn)成本，對殼聚糖酶的應(yīng)用尤其是酶法制備低分子量殼寡糖具有極其顯著的經(jīng)濟意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種一種發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的復(fù)合培養(yǎng)基。

背景技術(shù)

開發(fā)應(yīng)用殼寡糖(chitosan?oligosaccharide?COS)是甲殼素和殼聚糖天然資源開發(fā)應(yīng)用的核心問題,也是當(dāng)今生物制藥領(lǐng)域的熱點之一。殼寡糖,又稱低聚殼聚糖、低聚氨基葡萄糖等。相對于殼聚糖,殼寡糖不但水溶性好,易于吸收利用,還具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)血脂和血糖、增強免疫、活化腸道菌群等多種生理作用,具有比殼聚糖更優(yōu)越的生理及生化活性。隨著對殼寡糖生理作用機制研究的深入,殼寡糖在預(yù)防保健、疾病輔助治療以及日常生活其他方面的應(yīng)用將會愈發(fā)廣泛。現(xiàn)今殼寡糖主要制備方法有化學(xué)法、物理法和生物酶法。化學(xué)方法是最早用于工業(yè)化生產(chǎn)的殼寡糖制備方法,該方法的技術(shù)要求相對較低,降解快速,也易于實現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)。然而,化學(xué)法的產(chǎn)率低而且分子量分布較寬，單糖含量高,生產(chǎn)過程中產(chǎn)品的化學(xué)結(jié)構(gòu)可能遭到破壞,產(chǎn)品安全性飽受質(zhì)疑。從生產(chǎn)工藝的角度來說,化學(xué)方法的制備條件不易控制，可重復(fù)性差、脫鹽工藝復(fù)雜。物理法主要有超聲波法、微波法、射線法、光解法等。與化學(xué)法相比,物理法所具有的優(yōu)勢在于該法操作較為簡單，可控性好、污染小,如果和其他降解方式聯(lián)合使用可能會取得更好的效果。物理法降解普遍存在的問題是降解初期的速率較快,后期較緩慢,這意味著降解成更小的寡糖分子需要耗費很長的時間和較高的能量,單獨使用效果不佳,而且設(shè)備投資較大,目前仍未見工業(yè)化生產(chǎn)的報道。酶法降解是用專一性酶或非專一性酶對殼聚糖進行降解進而得到分子量較低的殼寡糖。酶水解法因條件溫和、分子量分布相對容易控制且不會導(dǎo)致還原端基的氧化和降解,反應(yīng)無需加入大量的化學(xué)試劑,對環(huán)境的污染較小,是一種公認的比較理想的綠色制備方法。

殼聚糖酶(chitisanase)是一類水解酶,1992年,殼聚糖酶被系統(tǒng)命名(Ec.3.2.1.99)。殼聚糖酶能催化水解完全脫乙酰的殼聚糖形成殼寡糖,同時也能選擇性切斷部分乙酰化殼聚糖的GlNc-GlNc和GlNc-GlNcAc。殼聚糖酶主要存在于真菌和細菌細胞中,在單子葉和雙子葉植物的不同組織中也發(fā)現(xiàn)有該酶活性。另外,在病毒中也發(fā)現(xiàn)殼聚糖酶。現(xiàn)己發(fā)現(xiàn)多種微生物中如Apergillusfumigatus,Psuedomanas,等都能產(chǎn)殼聚糖酶。這些酶大多為內(nèi)切酶。一般來說,植物中分離得到的殼聚糖酶分子量為10000-23000,而從微生物中分離得到的殼聚糖酶分子量為20000-40000。殼聚糖酶大部分為堿性蛋白,等電點Pl為7.0-8.5,最適pH為4.5-8.0。

但是目前殼聚糖酶發(fā)酵存在培養(yǎng)基成本高、酶發(fā)酵活力低等不足，其工業(yè)酶制劑的價格十分昂貴，如：丹麥諾維信公司生產(chǎn)的固體殼聚糖酶制劑(酶活力為400U/g)，其售價高達1200元/kg，我國浙江金殼集團生產(chǎn)的液體殼聚糖酶(300U/ml),售價也達到了800元/L。昂貴的酶價格限制了殼聚糖酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。因此，篩選出一種專用于殼聚糖酶的培養(yǎng)基，以提酶產(chǎn)量，這對降低殼寡糖生產(chǎn)成本具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種發(fā)酵生產(chǎn)殼聚糖酶的復(fù)合培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基成分每升中包括3-10g分子量為8000-10000Da的殼聚糖、7-18g酵母浸粉、10-20g葡萄糖。

進一步，所述的培養(yǎng)基成分每升中還包括肌醇0.01-0.03g、生物素0.03-0.05mg、鹽酸硫胺素7-10g、核黃素3.5-5g、維生素B12?3.0-4.5mg。

更進一步，所述的培養(yǎng)基的pH值為6.0-6.5。