[發明專利]一種肉牛肌肉細胞氧化損傷模型構建方法及應用

在審

• 申請號: 201811364324.8
• 申請日: 2018-11-16
• 公開（公告）號: CN109593708A
• 公開（公告）日: 2019-04-09
• 發明（設計）人: 張相倫;游偉;靳青;譚秀文;劉桂芬;趙紅波;魏晨;劉曉牧;萬發春;劉倚帆
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12Q1/02;C12Q1/26;C12Q1/30
• 代理公司: 濟南智圓行方專利代理事務所(普通合伙企業) 37231
• 代理人: 王君安

1.一種肉牛肌肉細胞氧化損傷模型構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一：配制細胞培養液：

將50-60份（體積份數）胎牛血清（FBS）、2-3份（體積份數）青鏈霉素混合液溶解在450-500份（體積份數）細胞培養液中，經過0.22微米濾膜過濾后分裝到滅菌的離心管中，每管40-45毫升，放置4℃保存，細胞培養前0.5-1小時將培養液放在37℃水浴鍋中預熱，得細胞培養液；

步驟二：分離肉牛肌肉組織：

剪取成年肉牛腹側肌肉組織10g-20g，用無菌生理鹽水沖洗2-3遍，迅速放在100mL含1-2%青鏈霉素液的磷酸鹽緩沖液（PBS）的樣品瓶中，封口膜封口后低溫運輸，在1-2小時內帶回實驗室；在無菌超凈臺內將肌肉組織從樣品瓶中取出后放在無菌平皿中，利用體式顯微鏡剔除筋膜及多余脂肪組織，再用PBS沖洗3-5遍，之后用眼科剪刀將肌肉組織剪碎至乳糜狀；

步驟三：培養肉牛肌肉細胞：

用吸管吸取乳糜組織均勻放在培養瓶底壁，然后翻轉培養瓶加入配制好的細胞培養液，將培養瓶平放入培養箱中，30-40分鐘后翻轉培養瓶，讓培養液慢慢浸沒培養瓶底壁的乳糜組織，并重新將培養瓶放回培養箱繼續培養38-48小時后細胞貼壁生長，5-6天后有80%-90%細胞貼壁；得到肌肉細胞：

步驟四：氧化損傷模型構建參數的獲取：

將分離得到的貼壁肌肉細胞消化后制備細胞懸著液，調整細胞懸著液的細胞濃度為5×10⁴個/mL，將細胞懸著液接種于96孔板中，在培養箱中培養24小時，然后更換為H₂O₂（0，50，100，150，200，250，300，350，400，450μM）培養液處理24小時，利用Cell Counting Kit-8試劑盒檢測細胞存活率，當H₂O₂升至300μM時，細胞存活率降至60%左右，繼續提高濃度細胞發生大量死亡；另將5×10⁴個/mL的細胞懸著液接種于25 cm²培養瓶中，待細胞匯合至80%時，更換為H₂O₂（0，50，100，150，200，250，300，350，400，450μM）培養液處理24小時，收集細胞，檢測超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、蛋白質羰基（PC）和8-羥基脫氧鳥苷（8-OHG），發現SDO和CAT活性先升高后降低，MDA、PC和8-OHG逐漸升高；得出300μMH₂O₂為氧化損傷模型的有效作用濃度。

2.根據權利要求1所述的肉牛肌肉細胞氧化損傷模型構建方法，其特征在于，步驟一中所述細胞培養液為（DMEM/F12）。

3.根據權利要求1或2所述的肉牛肌肉細胞氧化損傷模型構建方法，其特征在于，步驟四中所述細胞懸著液的調整細胞濃度為5×10⁴個/mL。

4.根據權利要求1-3任一項所述的肉牛肌肉細胞氧化損傷模型構建方法，其特征在于，步驟四中采用300μM H₂O₂對肉牛肌肉細胞處理45 min、1.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h，測定細胞存活率、SOD、CAT、MDA、PC和8-OHG，發現隨著處理時間的延長，細胞存活率逐漸降低，處理6小時存活率降至61.2%，SOD和CAT活性先升高后降低，MDA、PC和8-OHG均逐漸升高；綜合各項指標，得出300μM H2O2作用時間為6 h為宜。

5.根據權利要求1-4任一項所述的肉牛肌肉細胞氧化損傷模型構建方法，其特征在于，步驟四中得出的氧化損傷模型的有效作用濃度300μM H₂O₂，作用時間為6 h。

6.根據權利要求1-5任一項所述的肉牛肌肉細胞氧化損傷模型構建方法，其特征在于，步驟四中所述肉牛肌肉細胞氧化損傷模型建立的適宜參數為300 μM H₂O₂處理時間為6 h。