[發(fā)明專利]抗大黃魚IgM單克隆抗體及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811360852.6
• 申請日: 2018-11-15
• 公開（公告）號: CN109400706B
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發(fā)明（設計）人: 陳新華;黃宇鵬
• 申請（專利權）人: 福建農(nóng)林大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C12N15/06
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

抗大黃魚IgM單克隆抗體及其制備方法。抗大黃魚IgM單克隆抗體為雜交瘤細胞株IgM?9G7。制備大黃魚IgM抗原；制備雜交瘤細胞株IgM?9G7；制備抗大黃魚IgM的單克隆抗體。大黃魚IgM單克隆抗體是由雜交瘤細胞株IgM?9G7產(chǎn)生、對大黃魚IgM具有特異性的抗體。該細胞分泌的免疫球蛋白能夠高效特異性結合大黃魚IgM，最高效價達到2×10⁴。將純化的大黃魚IgM免疫動物，取其產(chǎn)生抗大黃魚IgM單克隆抗體的脾細胞與骨髓瘤細胞融合獲得能夠分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株，該細胞株能分泌抗大黃魚IgM的單克隆抗體。此抗體特異性高，靈敏度高，可用于大黃魚IgM的結構分析、免疫應答水平檢測等。

技術領域

本發(fā)明涉及單克隆抗體及其制備方法，尤其是涉及一種抗大黃魚(Larimichthyscrocea)IgM的單克隆抗體及其制備方法。

背景技術

我國是世界第一水產(chǎn)養(yǎng)殖大國。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大及養(yǎng)殖種類的多樣化，養(yǎng)殖病害防治問題日益突出，成為水產(chǎn)科研工作者的研究重點。從魚類自身的免疫能力出發(fā)來研究其抵御疾病侵襲的機理，不僅有助于認識脊椎動物免疫系統(tǒng)的進化規(guī)律及特點，而且有助于促進魚類疫苗的研制和發(fā)展。魚類是最早出現(xiàn)免疫球蛋白的生物，雖然與哺乳動物的免疫系統(tǒng)相比還比較原始，但是已經(jīng)形成包括非特異性免疫反應、細胞免疫、體液免疫等比較完善的免疫應答系統(tǒng)。

免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)是魚類特異性免疫中關鍵的分子。IgM是B淋巴細胞表面分子標志，目前在大黃魚血清中僅發(fā)現(xiàn)了IgM一種大黃魚免疫球蛋白，其重鏈約74kD，輕鏈約25kD([1]韓一凡.溶藻弧菌外膜蛋白DNA重組表達載體的構建及兔抗大黃魚IgM血清制備[D]；中國海洋大學,2006)。借助高質(zhì)量的抗大黃魚IgM單克隆抗體，可進行大黃魚IgM⁺B淋巴細胞分選，將為大黃魚B淋巴細胞的功能及相關免疫學機制研究提供幫助。此外，魚類感染病原或接種疫苗后，魚體產(chǎn)生的針對該抗原的特異性抗體，也可以通過該單克隆抗體進行特異性抗體效價檢測([2]ZHANG Y A,SALINAS I,LI J,et al.IgT,aprimitive immunoglobulin class specialized in mucosal immunity[J].NatureImmunology,2010,11(9):827)。因此，利用抗大黃魚IgM單克隆抗體，通過檢測大黃魚血清中該特異性IgM的效價，可進行大黃魚疾病的診斷和疫苗使用效果的評價，對大黃魚疾病的研究及防治具有重要理論和現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于為了解決利用單克隆抗體研究大黃魚免疫球蛋白結構與功能，將單克隆抗體用于大黃魚病原微生物檢測，協(xié)助魚病診斷與防治等，提供抗大黃魚IgM單克隆抗體及其制備方法。

所述抗大黃魚IgM單克隆抗體為雜交瘤細胞株IgM-9G7，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為武漢武漢大學，保藏中心保藏編號為CCTCC NO：C2018104，保藏日期為2018年05月15日。

所述大黃魚IgM單克隆抗體的制備方法包括以下步驟：

1)制備大黃魚IgM抗原；

在步驟1)中，所述制備大黃魚IgM抗原的具體方法可為：將大黃魚麻醉，進行尾部取血，采血后凝固，放置，待血清充分析出后，離心取上層血清，將血清與PBS稀釋，過濾后使用蛋白A親和柱和分子篩得到大黃魚血清中的IgM抗原，該IgM抗原蛋白包括重鏈和輕鏈，所述重鏈為76kD，所述輕鏈為25kD；所述大黃魚麻醉可采用MS-222麻醉劑麻醉；所述尾部取血可采用2mL醫(yī)用注射器；所述凝固可在室溫下凝固1h；所述放置可于4℃放置12h；所述離心的條件可為3000g，5min；所述將血清與PBS稀釋可將血清與pH值為8的PBS等比稀釋；所述過濾可采用0.45μm濾膜過濾，所述濾膜與蛋白A親和柱、分子篩均為業(yè)內(nèi)常用工具；所得到的大黃魚血清中的IgM抗原為高純度的大黃魚血清IgM。

2)制備雜交瘤細胞株IgM-9G7；