[發明專利]一種產D-泛解酸內酯水解酶的基因工程菌及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 201811358233.3
• 申請日: 2018-11-15
• 公開（公告）號: CN109456908A
• 公開（公告）日: 2019-03-12
• 發明（設計）人: 張梁;辛瑜;王開放;王大偉;顧正華
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/55;C12N15/81;C12N9/18;C12P41/00;C12R1/645
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 何金錦

1.一種產D-泛解酸內酯水解酶的基因工程菌，其特征在于，所述工程菌的構建方法為：將D-泛解酸內酯水解酶的編碼基因轉入宿主乳酸克魯維酵母細胞中，制得所述工程菌；所述工程菌內含有重組載體pZL505-DL的核苷酸片段，所述的DL序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根據權利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述宿主為乳酸克魯維酵母GG799。

3.一種權利要求1所述產D-泛解酸內酯水解酶的基因工程菌的構建方法，其特征在于，所述構建方法包括如下步驟：

(1)以合成的DL序列為模板，利用SEQ ID NO:2所示的序列為上游引物，SEQ ID NO:3所示的序列為下游引物通過反應獲得產物，再用XhoⅠ和KpnⅠ對PCR產物和pZL505載體進行雙酶切后連接獲得重組載體pZL505-DL；

(2)利用大腸桿菌感受態細胞擴增所述重組表達載體并收集擴增產物，將所述擴增產物用SacⅡ進行酶切后轉化宿主細胞獲得基因工程菌。

4.一種權利要求1所述產D-泛解酸內酯水解酶的基因工程菌的應用，其特征在于，用于水解D-泛解酸內酯或拆分DL-泛解酸內酯。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述水解D-泛解酸內酯或拆分DL-泛解酸內酯的方法為：將基因工程菌接種至培養基中培養，獲得發酵粗酶液后用樹脂吸附，制成酶制劑；之后再將酶制劑用于水解D-泛解酸內酯內酯或拆分DL-泛解酸內酯。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述培養基的組成為蔗糖40g/L、蛋白胨20g/L、牛肉膏15g/L、NaCl 6g/L、KCl 6g/L、CaCl₂ 3g/L、MgSO₄3g/L。

7.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述酶制劑的制備方法為：以樹脂D380為載體，以戊二醛作為交聯劑，D-泛解酸內酯水解酶的添加量10～50U/g樹脂，吸附pH 6.5～7.5，吸附溫度20～35℃，吸附時間3～8h；戊二醛終濃度0.1～1％，交聯時間0.5～3h。

8.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述培養條件為：25～35℃溫度條件下，150～200rpm，培養時間為70～90h。