[發明專利]一種針對EGFR T790M位點突變進行檢測的試劑盒

在審

• 申請號: 201811349497.2
• 申請日: 2018-11-13
• 公開（公告）號: CN109652539A
• 公開（公告）日: 2019-04-19
• 發明（設計）人: 徐志勇;秦偉
• 申請（專利權）人: 武漢千麥醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 武漢紅觀專利代理事務所(普通合伙) 42247
• 代理人: 陳凱

本發明提出了一種新的針對EGFR T790M位點基因突變檢測的試劑盒，運用了雙相酶系統RNase H2和DNA聚合酶技術，由于采用的是雙酶系統擴增法，在普通引物的基礎上有所改變，即在引物序列SEQ ID NO.1的3'端連接有間隔臂x，這樣使引物能夠特異地與模板序列結合，并在RNase H2剪切后能特異擴增；設計了針對EGFR T790M突變位點的引物探針，采用熒光PCR，封閉式檢測，減少了后期污染的可能性；本發明提供的試劑盒的敏感度高，檢測快速，穩定性好，封閉式檢測，減少了后期污染的可能性。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種針對EGFR T790M位點突變進行檢測的試劑盒。

背景技術

近年來，以表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)為治療靶標的分子靶向治療(Molecular Targeted Therapy)受到了國內外腫瘤界的普遍關注，其中EGFR酪氨酸激酶抑制劑Genfitinib(又稱Iressa)和Erlotinib(又稱Tarceva)已被美國食品藥品管理局(FDA)批準用于治療晚期非小細胞肺癌(NSCLC)，并且Gefitinib還分別獲得包括日本、澳大利亞等27個國家的批準，我國也于2005年2月批準了Genfitinib進入臨床。

資料顯示，大量臨床研究證實，EGFR突變陽性者對EGFR-TKI的有效率為50％～80％，而野生型患者的有效率僅約10％～15％。而且，診斷明確的NSCLC病人，給予吉非替尼或埃羅替尼治療，治療開始階段病情有明顯改善，但在繼續用藥過程中病情復發，有研究證實可能是EGFR基因編碼區出現T790M(2369C>T)突變造成的藥物失效，需要及時更換新的有效抑制劑或應用其它治療方法。

關于T790M突變造成耐藥的研究早已有報道。2005年2月Kobayashi等發表于《NEngl J Med》上的文章對1例治療前組織中有del L747-S752位點缺失突變、接受吉非替尼二線治療達完全緩解28個月后疾病進展的71歲患者進行了二次活檢，分析其活檢組織基因突變狀況，發現在原有突變基礎上EGFR確實發生了新的基因突變，即在20外顯子790位上密碼子發生了錯義突變(T790M)，從而使EGFR重新處于被激活狀態。研究者因此認為獲得性耐藥源自T790M突變引起酪氨酸激酶域空間構象改變，影響其與吉非替尼、埃羅替尼的結合，此外繼發突變亦極大地減弱了EGFR-TKI與激酶域之間氫鍵的親和力。

無獨有偶，2005年3月另一組發表于《PLoS Medicine》，有關EGFR突變與耐藥的報道接踵而至。Pao等通過檢測6例疾病進展后原發與轉移活檢標本EGFR突變及Kras突變，發現其中3例存在T790M錯義突變，初治前及疾病進展后的標本均無Kras突變。同時采用PCR-RFLP驗證了上述結果，為進一步證實T790M并非原發突變，作者回顧性研究了155例NSCLC患者治療前腫瘤組織EGFR，結果無1例攜帶T790M突變。

但也有的文獻報道T790M突變亦存在于治療前腫瘤組織中。

因此，通過檢測EGFR基因突變型，可以從晚期肺癌病人中篩選出最適治療對象進行個體化治療，從而顯著提高藥物療效，節約資源。這一基因診斷新技術應用于臨床，每年可使數百萬癌癥病人得益，其社會意義和經濟價值均十分顯著。

體細胞突變目前最常用的方法是ARMS-PCR法，即擴增受阻突變系統熒光PCR法，該方法主要用來檢測點突變，尤其是檢測突變含量很低的體細胞突變。

熒光PCR的優點是反應靈敏、特異性高：具有模板序列特異的Taqman探針在引物特異的基礎上進一步提高的PCR的專一性；每擴增一個特異產物只釋放一個分子的熒光染料，儀器檢測的是特異擴增的結果，非特異產物對檢測信號沒有影響，有效提高檢測的專一性。有多種不同波長的熒光基團對可供選擇，使得Taqman探針法可以實現在同一管內檢測多重PCR，降低成本也提高效率和準確性避免了熒光染料對PCR反應的影響。