[發(fā)明專利]一種檢測miR5100、CXCL-12和IL-8相對表達量的方法

在審

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• 申請日: 2018-11-13
• 公開（公告）號: CN109234365A
• 公開（公告）日: 2019-01-18
• 發(fā)明（設計）人: 廖興華;張慧敏;項園;黃鳳;戴周彤;張子健;李含含;范麗娟;姚奧;李佳蓬;李慧;杜慶;張同存
• 申請（專利權）人: 武漢科技大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 武漢紅觀專利代理事務所(普通合伙) 42247
• 代理人: 陳凱

1.一種檢測miR5100、CXCL-12和IL-8相對表達量的方法，其特征在于：所述方法包括：樣品中總RNA的提取、RNA反轉錄反應和實時熒光定量PCR。

2.如權利要求書1所述的一種檢測miR5100、CXCL-12和IL-8相對表達量的方法，其特征在于：所述樣品中總RNA的提取，使用試劑盒為RNAiso Plus，包括以下步驟：

(1)抽取受試者血液4ml，4℃放置備用；

(2)向200ul全血中加入1ml RNAiso Plus，冰上裂解10min；

(3)加入200ul的氯仿，混合均勻，冰上靜置5min；

(4)4℃12000g/min離心10min，收取上清液于無RNA酶的1.5ml離心管；

(5)向離心管中加入與上清液等體積的異丙醇，混勻，冰上靜置10min；

(6)4℃12000g/min離心10min，棄上清液；

(7)加入1ml用DEPC水稀釋的75％乙醇，7500g/min離心2min；

(8)棄上清液，干燥5min；

(9)加20ul DEPC水，溶解；

(10)使用Nanodrop 2000測定RNA濃度，保留OD260/OD280值在1.8-2.0之間的樣品。

3.如權利要求1所述的一種檢測miR5100、CXCL-12和IL-8相對表達量的方法，其特征在于：所述RNA反轉錄反應，使用試劑盒為PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，包括以下步驟：

(1)基因組DNA的去除反應：在微量管里加入5x gDNA Eraser Buffer 2.0ul、gDNAEraser 1.0ul、Total RNA 1.0ug和RNase Free dH₂O補足到10ul，42℃去除基因組DNA反應2min；

(2)反轉錄反應：向步驟(1)的微量管里分別加入RNase Free dH₂O 4ul、5xPrimeScript Buffer(for Real Time)4.0ul混合后再加入RT Primer Mix1.0ul和PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0ul輕輕混勻；反應條件為：37℃逆轉錄15min、85℃變性5s，4℃冷藏保存。

4.如權利要求3所述的一種檢測miR5100、CXCL-12和IL-8相對表達量的方法，其特征在于：所述RNA反轉錄反應條件為37℃逆轉錄30min。

5.如權利要求1所述的一種檢測miR5100、CXCL-12和IL-8相對表達量的方法，其特征在于：所述實時熒光定量PCR，包括對miR5100進行實時熒光定量PCR、對CXCL-12進行實時熒光定量PCR和對IL-8進行實時熒光定量PCR。

6.如權利要求5所述的一種檢測miR5100、CXCL-12和IL-8相對表達量的方法，其特征在于：所述對miR5100進行實時熒光定量PCR，所用試劑盒為Hieff qPCR SYBR Green MasterMix(No Rox)，qPCR反應體系為20ul：2X SYBR Green Mix 10ul、cDNA 2ul、U6上游引物0.8ul、U6下游引物0.8ul、ddH₂O補足20ul；qPCR反應程序為：95℃預變性5min、95℃變性10s、60℃退火20s、72℃延伸20s，共40個循環(huán)；溶解曲線95℃變性15s、60℃復性60s、95℃變性15s，U6作為miR5100內(nèi)參。