[發明專利]一種提高煙葉提取物中萜類代謝酶酶活的提取方法

在審

• 申請號: 201811346922.2
• 申請日: 2018-11-13
• 公開（公告）號: CN109321537A
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 翟妞;張慧;陳千思;周會娜;劉萍萍;徐國云;鄭慶霞;許亞龍;李晶;王晨;金立鋒
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙) 41104
• 代理人: 時立新

本申請屬于煙草代謝物技術領域，具體涉及一種提高煙葉提取物中萜類代謝酶酶活專利申請事宜。該方法針對針對新鮮煙葉中萜類代謝酶的提取，具體包括：制備提取液（采用裂解液RIPA、緩沖液NEB或PBS）、煙葉預處理、溶液法提取等步驟。初步測定結果表明，提取液中DXR酶活得到了較好提高，可達3.5×10^?4U/μg全蛋白，而HMGR酶活可達6.7×10^?4U/μg全蛋白，較好達到了減少雜質蛋白干擾、提升DXR酶和HMGR酶含量的目的。同時由于相關提取方法簡單快速、耗時較短（僅1.5 h左右），因此使得本申請具有較好的科研價值，可為DXR和HMGR活性分析及其它相關蛋白分析和研究奠定技術基礎。

技術領域

本申請屬于煙草代謝物技術領域，具體涉及一種提高煙葉提取物中萜類代謝酶酶活提取方法專利申請事宜。

背景技術

煙草作為一種較為特殊的經濟作物，其產量與品質直接關系到我國國民經濟的健康發展。為了研究煙草基因功能，創制新的育種材料，對煙草代謝物進行深入研究和分析顯然具有十分重要的意義。

煙草中的香氣物質是煙草內形成的一類次生代謝產物，目前按照致香功能團可分為酸類、醇類、酮類、醛類、酯類、酚類等，其中對煙草香氣貢獻最大的3 類物質分別為多酚類化合物、萜類化合物以及生物堿。其中萜類物質可分別由甲基赤蘚醇4-磷酸途徑(MEP)和甲羥戊酸途徑(MVA)途徑這2 條獨立途徑生成。DXR在MEP途徑的第二步中催化DXP（1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸酯）生成MEP，在此步驟中，由于DXP被認為是硫胺素（維生素B1）和吡哆醇（維生素B6）的前體物，所以DXR催化DXP的步驟常被用于MEP途徑中碳硫分流的研究，同時該步驟也是質體中萜類化合物合成的重要調控位點。而HMGR在MVA途徑中催化3-羥基-3甲基-戊二酰輔酶A生成甲羥戊酸，該過程是萜類合成過程中的重要步驟，而且該反應不可逆，所以將HMGR稱為MVA途徑中的第一個限速酶。由于1-脫氧木酮糖還原酶（DXR）和3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）在相關次生代謝產物中的關鍵性節點作用，因此對于這兩個萜類代謝酶的深入研究，對于煙草生理生化的深入研究、以及煙草新材料鑒定、新品種培育都具有十分重要的意義。

現有技術中，植物蛋白（包括生物酶）的提取方法主要有兩種：溶液法和沉淀法。其中沉淀法因其提取過程中采用了變性劑，會導致部分蛋白酶結構改變并失去活性，因此沉淀法并不適合煙草葉片全蛋白的提取。而在應用溶液法進行提取時，由于不同蛋白（生物酶）特性不同，因此具體提取所選擇的提取液及提取工藝也往往缺乏可借鑒性，往往均需重新設計。而現有技術中尚未見到較好的提取萜類代謝酶提取方法報道。

發明內容

本申請目的在于提供一種提高煙葉提取物中萜類代謝酶酶活提取方法，從而為煙草生長代謝研究奠定一定方法學基礎。

本申請所采取的技術方案詳述如下。

一種提高煙葉提取物中萜類代謝酶酶活的提取方法，該方法針對新鮮煙葉中萜類代謝酶的提取，所述萜類代謝酶主要指：1-脫氧木酮糖還原酶（DXR）和3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A還原酶（HMGR），具體包括如下步驟：

（1）制備提取液，具體可采用裂解液RIPA 、NEB或PBS；配方組成為：

裂解液RIPA ：Tris-Cl（pH 8.0）、50 mM，EDTA、1mM，SDS、0.1%，NaCl、150 mM，NP-40、1%，PMSF、1 mM；

緩沖液NEB： Hepes（pH 7.5）、20mM，KCl、40 mM，EDTA、1 mM，NP-40、1%，PMSF、1 mM；

pH 8.0的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na₂HPO₄ 9.5 mM，NaH₂PO₄、0.5 mM，PMSF、1mM；