[發明專利]一株發酵產L-天冬氨酸的基因工程菌及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 201811346790.3
• 申請日: 2018-11-13
• 公開（公告）號: CN109370971A
• 公開（公告）日: 2019-02-22
• 發明（設計）人: 馬江鋒;儲樂樂;董維亮;信豐學;章文明;方艷;姜岷
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/90;C12N15/31;C12P13/20;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 徐蓓

1.一株發酵產L-天冬氨酸的基因工程菌，其分類命名為Escherichia coli △iclR，其保藏號為CCTCC NO：M 2018521。

2.根據權利要求1 所述的發酵產L-天冬氨酸的基因工程菌，其特征在于，敲除出發菌株aceBAC操縱子的阻遏基因iclR，得到所述基因工程菌，所述出發菌株的保藏號為CGMCCNO：2301，所述iclR基因序列如SEQ ID NO：1所示。

3.權利要求1 所述發酵產L-天冬氨酸的基因工程菌的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）以SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列為引物，質粒pTarget F為模板，PCR擴增得到線性片段1；

（2）將線性片段1用SpeI酶切后進行連接，并將連接后產物轉化到感受態中，涂布大觀霉素的LB平板篩選出陽性重組子；

（3）將陽性重組子接種于添加大觀霉素的LB液培擴繁后進行質粒抽提，獲得pTargetT1質粒；

（4）以SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列為引物，大腸桿菌基因組為模板，PCR擴增得到線性片段2；以SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列為引物，大腸桿菌基因組為模板，PCR擴增得到線性片段3；

（5）以SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列為引物，片段2和片段3的混合物為模板，重疊PCR擴增得到線性片段4；

（6）將pTarget T1質粒用EcoRI線性化后去磷酸化作為載體，與片段4進行吉布森一步克隆，用大觀霉素的LB平板篩選出陽性重組子；

（7）將步驟（6）中的陽性重組子接種于添加大觀霉素的LB液培擴繁后進行質粒抽提，獲得pTarget T2質粒；

（8）將pCas質粒導入保藏號為CGMCC NO：2301的出發菌株中，用卡那霉素的LB平板篩選出陽性重組子；

（9）將步驟（8）中的陽性重組子用阿拉伯糖誘導，制備為感受態；

（10）將pTarget T2質粒導入步驟（9）的感受態中，用添加大觀霉素和卡那霉素的LB平板篩選出陽性重組子；

（11）將步驟（10）中的陽性重組子用PCR的方法進行鑒定，篩選出目的基因工程菌株。

4.權利要求1所述發酵產L-天冬氨酸的基因工程菌在發酵制備L-天冬氨酸中的應用。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述應用的種子液培養過程如下：

(S1)將所述基因工程菌轉接到LB培養基中，有氧培養10～12h，得到一級種子液；

(S2)將一級種子液轉接到發酵罐LB培養基中培養，得到二級種子液 ；

(S3)待二級種子液OD₆₀₀至8.5時，再接種到發酵培養基，所述發酵培養基的配方如下：

M9培養基：(NH₄)₂SO₄ 6g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 15.2g/L，KH₂PO₄ 3g/L，NaCl 0.5g/L，NH₄Cl1g/L，MgSO₄ 2mM，CaCl₂ 0.1mM，100g/L葡萄糖。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，步驟(S1)和(S2)中，培養溫度為35～37℃。

7.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，步驟(S3)中，溶解氧控制在5～40％。

8.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，步驟(S3)發酵過程中溫度為28~30℃，培養過程pH用氨水調節為7.0。