[發明專利]一種適用于新鮮煙草葉片全蛋白的提取方法

在審

• 申請號: 201811346576.8
• 申請日: 2018-11-13
• 公開（公告）號: CN109293733A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 翟妞;劉萍萍;徐國云;周會娜;陳千思;張慧;鄭慶霞;李晶;王晨;金立鋒;許亞龍
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙) 41104
• 代理人: 時立新

本申請屬于煙草代謝物技術領域，具體涉及一種適用于苗期新鮮煙草葉片全蛋白的提取方法專利申請事宜。方法針對苗期新鮮煙葉適用，具體包括：制備提取液（采用裂解液RIPA、緩沖液NEB或PBS）、煙葉預處理、溶液法提取等步驟。初步測定結果表明，經過相關提取工藝參數優化后，本申請所提供提取方法的蛋白提取量雖然中等，但雜質少，蛋白提取效果更好，而且由于相關提取方法簡單方便，耗時較短（僅1.5 h左右），因此使得本申請具有較好的科研價值，可為目標蛋白一般免疫印跡、免疫共沉淀等相關蛋白分析和研究奠定技術基礎。

技術領域

本申請屬于煙草代謝物技術領域，具體涉及一種適用于苗期新鮮煙草葉片全蛋白的提取方法專利申請事宜。

背景技術

煙草作為一種較為特殊的經濟作物，其產量與品質直接關系到我國國民經濟的健康發展。為了研究煙草基因功能，創制新的育種材料，對基因表達產物蛋白質進行深入研究和分析顯然具有十分重要的意義。

蛋白質研究中，蛋白樣品的制備是分析的起始和基礎，因此蛋白提取質量和效果對后續的研究分析有重要影響。而由于煙草葉片含有較厚的細胞壁，又給煙草蛋白質的提取增加了一定的難度?，F有技術中，植物蛋白的提取方法主要有兩種：溶液法和沉淀法。其中沉淀法因其提取過程中采用了變性劑，會導致部分蛋白酶結構改變并失去活性，因此沉淀法并不適合煙草葉片全蛋白的提取。而在應用溶液法進行提取時，由于不同生物、以及不同生長時期的蛋白特性不同，因此具體提取時所選擇的提取液及提取工藝也往往缺乏可借鑒性，往往均需重新設計。而針對煙草質量分析及新品種培育而言，建立一種針對新鮮煙草葉片的、簡單快速高效的全蛋白提取方法，對于煙草功能基因研究和煙草新材料創制都具有十分重要的應用意義。

發明內容

本申請目的在于提供一種適用于苗期新鮮煙草葉片全蛋白的提取方法，從而為煙草生長代謝研究奠定一定方法學基礎。

本申請所采取的技術方案詳述如下。

一種適用于新鮮煙草葉片全蛋白的提取方法，該方法針對苗期新鮮煙葉適用，具體包括如下步驟：

（1）制備提取液，具體可采用裂解液RIPA、NEB或不同pH的PBS；配方組成為：

裂解液RIPA：Tris-Cl（pH 8.0）、50 mM，EDTA、1mM，SDS、0.1%，NaCl、150 mM，NP-40、1%，PMSF、1 mM；

緩沖液NEB： Hepes（pH 7.5）、20mM，KCl、40 mM，EDTA、1 mM，PMSF、1 mM；

pH 8.0的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na₂HPO₄ 9.5 mM，NaH₂PO₄、0.5 mM，PMSF、1mM；

pH7.2的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na₂HPO₄ 7.2 mM，NaH₂PO₄、2.8 mM，PMSF、1 mM；

pH 6.0的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na₂HPO₄ 1.2 mM，NaH₂PO₄、8.8 mM，PMSF、1mM；

（2）煙葉預處理

將栽培煙草K326（或者NC82）8-12葉期的新鮮煙葉，液氮速凍后，研磨成粉。

（3）溶液法提取

在步驟（2）研磨成粉煙葉樣品中加入步驟（1）中制備的提取液（裂解液），震蕩混勻后，冰上靜置不少于1h；