[發(fā)明專利]基于黑尾葉蟬actin基因啟動子的昆蟲細(xì)胞外源蛋白表達(dá)載體

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811345890.4
• 申請日: 2018-11-13
• 公開（公告）號: CN109468321B
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張曉峰;魏太云;謝云杰;王海濤;王娟;陳紅燕
• 申請（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

本發(fā)明提供基于黑尾葉蟬actin基因啟動子的昆蟲細(xì)胞外源蛋白瞬時表達(dá)載體，所述啟動子序列如SEQ ID NO.1所示。基于克隆擴增的啟動子序列，通過改造pEGFP?N1載體，成功構(gòu)建了能夠在葉蟬培養(yǎng)細(xì)胞系中瞬時表達(dá)外源蛋白的質(zhì)粒載體,Nc_Hr5cyto?GFP。將優(yōu)化葉蟬肌動蛋白（Actin）基因的promoter，構(gòu)建適合于介體葉蟬培養(yǎng)細(xì)胞的瞬時表達(dá)載體，為研究植物病毒的侵染機制開辟新的技術(shù)手段。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)，具體涉及基于黑尾葉蟬actin基因啟動子的昆蟲細(xì)胞外源蛋白瞬時表達(dá)載體。

背景技術(shù)

由于昆蟲介體本身體積小，壽命短，各種器官組織非常精細(xì)復(fù)雜，而且很多病毒基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前尚不易得到侵染性克隆，不能利用反向遺傳學(xué)的手段進(jìn)行研究。這導(dǎo)致在昆蟲個體中研究病毒基因功能非常困難。昆蟲細(xì)胞系的出現(xiàn)為研究昆蟲病毒提供了有力的平臺。到目前為止, 全世界建立的昆蟲細(xì)胞系有800多株, 分別來源于鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、蜚蠊目、膜翅目、直翅目、同翅目和半翅目等8個目的170多種昆蟲, 然而其中大部分來自鱗翅目和雙翅目, 來源于其他目的昆蟲細(xì)胞系僅占1/10 左右(張寰等，2007)。很多昆蟲細(xì)胞系已經(jīng)商業(yè)化，例如果蠅的胚胎S2細(xì)胞系、草地貪夜蛾細(xì)胞 sf9/sf21細(xì)胞系和白紋伊蚊C6/36細(xì)胞株等。這些細(xì)胞系作為模式昆蟲平臺已廣泛應(yīng)用于研究動植物病毒侵染及其與介體昆蟲的互作關(guān)系的基礎(chǔ)科學(xué)研究。適應(yīng)于植物病毒侵染的蚜蟲、葉蟬、粉虱、薊馬和稻飛虱的原代和繼代細(xì)胞體系也已建立（Adam et al., 1976; Kimura et al.,1988; Hunter et al., 1995; Hunter et al., 2001; Ma et al., 2013）。值得一提的是，近年來，申請人課題組已建立了適應(yīng)于水稻病毒持久侵染的黑尾葉蟬、電光葉蟬、灰飛虱、白背飛虱及褐飛虱細(xì)胞系，成功用于研究水稻病毒的增殖機制與其介體昆蟲的互作關(guān)系（Wei et al., 2006a, 2007, 2009; Ma et al., 2013; Chen et al., 2015）。

昆蟲細(xì)胞系優(yōu)勢的發(fā)揮，離不開相應(yīng)表達(dá)載體的應(yīng)用。利用各種轉(zhuǎn)染方法，通過表達(dá)載體在昆蟲細(xì)胞內(nèi)研究病毒蛋白的細(xì)胞定位及其與介體的互作，是深入研究病毒侵染機理必不可少的技術(shù)手段。每一種成熟的昆蟲細(xì)胞系都有一套甚至幾套與之相對應(yīng)的瞬時表達(dá)系統(tǒng)，例如適于轉(zhuǎn)染果蠅細(xì)胞系S2 的pAc5.1/V5-His/ pMT/BiP/V5 載體系統(tǒng)。高效的瞬時表達(dá)載體的開發(fā)和應(yīng)用，能夠極大的發(fā)揮昆蟲細(xì)胞系的作用。如在無病毒其他蛋白干擾下研究病毒單個蛋白或者多個蛋白功能在介體細(xì)胞中的定位與功能，可深入研究病毒在介體細(xì)胞中的侵染機制。大多數(shù)瞬時表載體都是利用相應(yīng)昆蟲細(xì)胞內(nèi)源基因的啟動子（promoter）來轉(zhuǎn)錄目標(biāo)基因的mRNA。例如pAc5.1/V5-His就是經(jīng)過擴增優(yōu)化了果蠅肌動蛋白（Actin） 基因的promoter（Angelichio et al., 1991）。這種載體系統(tǒng)的使用目前大多僅限于動物病毒侵染的細(xì)胞系。而適應(yīng)于轉(zhuǎn)染植物病毒的水稻介體昆蟲-葉蟬和飛虱昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的瞬時表達(dá)系統(tǒng)目前還沒開發(fā)成功，這極大限制了植物病毒在介體細(xì)胞內(nèi)侵染機制的研究。為此，本發(fā)明將優(yōu)化葉蟬肌動蛋白（Actin）基因的promoter，構(gòu)建適合于介體葉蟬培養(yǎng)細(xì)胞的瞬時表達(dá)載體，為研究植物病毒的侵染機制開辟新的技術(shù)手段。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供基于黑尾葉蟬actin基因啟動子的昆蟲細(xì)胞外源蛋白瞬時表達(dá)載體。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

黑尾葉蟬actin基因啟動子，所述啟動子序列如SEQ ID NO.1所示。

含所述的黑尾葉蟬actin基因啟動子的昆蟲細(xì)胞外源蛋白瞬時表達(dá)載體。