[發(fā)明專(zhuān)利]短鏈脂肪酸的定量方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811345448.1
• 申請(qǐng)日: 2018-11-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111175426A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-05-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 詹華強(qiáng);董婷霞;王懷友;汪成
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 香港科技大學(xué)深圳研究院
• 主分類(lèi)號(hào): G01N30/88
• 分類(lèi)號(hào): G01N30/88
• 代理公司: 深圳市順天達(dá)專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 44217
• 代理人: 郭偉剛

一種短鏈脂肪酸的定量方法，使用3?硝基苯肼作為衍生化試劑對(duì)生物排泄樣本中的短鏈脂肪酸進(jìn)行衍生化，以生成在紫外光區(qū)有特征吸收峰的短鏈脂肪酸衍生化產(chǎn)物，利用HPLC?UV法并基于分配色譜法原理在紫外光區(qū)下測(cè)定短鏈脂肪酸衍生化產(chǎn)物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)短鏈脂肪酸的定量檢測(cè)。本發(fā)明的短鏈脂肪酸的定量方法的準(zhǔn)確度、精密度高、檢測(cè)限低。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及定量檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種短鏈脂肪酸的定量方法，具體利用高效液相色譜法(HPLC-UV)對(duì)被處理過(guò)和/或未被處理過(guò)的生物排泄樣本(具體可采用人體糞便和/或糞便發(fā)酵液)中10種短鏈脂肪酸進(jìn)行定量分析，屬于內(nèi)源性物質(zhì)檢測(cè)技術(shù)方法。

背景技術(shù)

短鏈脂肪酸又稱(chēng)為揮發(fā)性脂肪酸，多是由腸道內(nèi)厭氧菌發(fā)酵未消化吸收的食物殘?jiān)刑妓衔锒a(chǎn)生的有機(jī)脂肪酸，包含乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸和異己酸等。短鏈脂肪酸的種類(lèi)、含量主要取決于腸道內(nèi)菌群種類(lèi)、宿主食物中的纖維含量以及消化的時(shí)間等。腸道中短鏈脂肪酸多數(shù)以離子形式存在，主要通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)體吸收利用。乙酸可被宿主吸收利用，提供人體日總能量的約10％；丙酸經(jīng)血液吸收后在肝臟中分解代謝，參與丙酮酸逆轉(zhuǎn)化為葡萄糖的過(guò)程，同時(shí)可能抑制脂肪的合成；丁酸主要被上皮細(xì)胞利用。腸道短鏈脂肪酸參與腸上皮細(xì)胞的能量供應(yīng)，可影響腸腔pH和電解質(zhì)平衡、腸黏膜屏障的通透性和腸道高敏感等，與腸道相關(guān)疾病有一定關(guān)系。最新研究發(fā)現(xiàn)，短鏈脂肪酸對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖能起到抑制作用，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化和凋亡，降低癌變的機(jī)率。因其在維持機(jī)體正常生理功能中具有重要作用，因此定量檢測(cè)正常生理狀態(tài)及病理狀態(tài)下腸道及糞便中該類(lèi)物質(zhì)的含量具有重要意義。

目前，生物樣品中的短鏈脂肪酸的定量方法有很多，包括氣相色譜(GC-FID)、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)，液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)等方法；其中GC-FID及GC-MS是最常用的測(cè)定方法，GC測(cè)定法多采用乙醚萃取和衍生化進(jìn)行分析，或用乙醚直接萃取后采用FFAP極性柱直接測(cè)定樣品中的短鏈脂肪酸。專(zhuān)利CN105021726A將糞便樣品以蒸餾水均質(zhì)處理后直接進(jìn)行GC-FID測(cè)定，然而該方法僅測(cè)定了6種短鏈脂肪酸，并未能對(duì)其他含量較少的短鏈脂肪酸進(jìn)行測(cè)定；且人體糞便樣品的色譜圖基線(xiàn)不穩(wěn)定，各短鏈脂肪酸分離效果較差。專(zhuān)利CN104807933A采用乙醇萃取后用GC-MS對(duì)乳品中的短鏈脂肪酸進(jìn)行檢測(cè)，該方法采用DB-FFAP極性色譜柱對(duì)乙醇提取液進(jìn)行分離；然而該方法由于前處理過(guò)程中引入酸的原因，提取的短鏈脂肪酸可能會(huì)與乙醇反應(yīng)，導(dǎo)致短鏈脂肪酸定量結(jié)果不準(zhǔn)確。專(zhuān)利CN105651908A，利用飽和食鹽水配制的鹽酸溶液酸化，乙酸乙酯萃取及N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺MTBSTFA衍生化后用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀定量檢測(cè)小鼠腸道內(nèi)容物和糞便樣品中11種短鏈脂肪酸；該方法雖然準(zhǔn)確度、精密度高，但是檢測(cè)費(fèi)用昂貴，并不適用于大部分檢測(cè)機(jī)構(gòu)和實(shí)驗(yàn)室。綜上，目前仍缺少適用性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、精密度高且檢測(cè)限低的短鏈脂肪酸檢測(cè)方法。

因此，建立一種適用性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高且檢測(cè)限低的生物排泄樣本中短鏈脂肪酸含量的測(cè)定方法是很有必要的。但到目前為止，還沒(méi)有搜索到類(lèi)似的檢測(cè)方法；特別是采用目前最為普通的HPLC-UV檢測(cè)糞便或糞便發(fā)酵液中短鏈脂肪酸的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，提出一種短鏈脂肪酸的定量方法。

本發(fā)明所提出的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提出了一種短鏈脂肪酸的定量方法，使用3-硝基苯肼作為衍生化試劑對(duì)生物排泄樣本中的短鏈脂肪酸進(jìn)行衍生化，以生成在紫外光區(qū)有特征吸收峰的短鏈脂肪酸衍生化產(chǎn)物，利用HPLC-UV法并基于分配色譜法原理在紫外光區(qū)下測(cè)定短鏈脂肪酸衍生化產(chǎn)物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)短鏈脂肪酸的定量檢測(cè)。

本發(fā)明上述的短鏈脂肪酸的定量方法中，包括以下步驟：

步驟S1、收集生物排泄樣本；按照預(yù)設(shè)比例采用乙腈萃取該生物排泄樣本中的短鏈脂肪酸，從而得到萃取液；在萃取液中加入3-硝基苯肼、EDC和吡啶以使萃取液中的短鏈脂肪酸衍生化，從而得到短鏈脂肪酸衍生化產(chǎn)物；