[發明專利]一種檢測灰霉病菌對啶酰菌胺抗性的引物組合、試劑盒和方法

有效

• 申請號: 201811345216.6
• 申請日: 2018-11-12
• 公開（公告）號: CN109338004B
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 劉欣;曾蓉;戴富明;高士剛;徐麗慧
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 賈顏維

本發明公開了一種檢測灰霉病菌對啶酰菌胺抗性的引物組合、試劑盒和方法，涉及農業科學技術領域。該引物組合包括如下引物組合中的一種或多種：引物組合1、引物組合2和引物組合3；其中，引物組合1包括：SEQ ID NO.1?3所示的引物；引物組合2包括：SEQ ID NO.4?7所示的引物；引物組合3包括：SEQ ID NO.8?11所示的引物。采用該引物組可以快速、有效地鑒別對啶酰菌胺有抗性的灰霉病菌，以及其對啶酰菌胺產生抗性的突變類型。

技術領域

本發明涉及農業科學技術領域，具體而言，涉及一種檢測灰霉病菌對啶酰菌胺抗性的引物組合、試劑盒和方法。

背景技術

草莓灰霉病(gray mold disease)是危害草莓生產和儲藏的最嚴重的病害之一。其病原灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.)還可侵染葡萄、黃瓜、番茄等200余種作物，產生軟腐、黑腐、霉變等癥狀，造成重大經濟損失。

琥珀酸脫氫酶抑制劑(SDHIs)是一類含酰胺基團的殺菌劑，其通過抑制病菌線粒體的電子傳遞鏈蛋白復合體Ⅱ(琥珀酸脫氫酶，SDH)活性而起到對作物的保護或治療效果。啶酰菌胺是2003年進入市場的吡啶酰胺類SDHI，低毒，且對核盤菌屬(Sclerotinia spp.)、鏈格孢屬(Alternaria spp.)、葡萄孢屬(Botrytis spp.)、球腔菌屬(Mycosphaerellaspp.)等真菌均具較好的抑制活性。啶酰菌胺對灰葡萄孢(B.cinerea)的孢子萌發、芽管伸長、附著胞形成、菌絲生長等均具高效的抑制作用，且在植物葉片及莖中具較好的內吸傳導特性，被證明對草莓灰霉病的田間防治高度有效。

由于B.cinerea繁殖速度快、孢子數量大且較易產生遺傳變異，屬易對藥劑產生抗性的一類植物病原真菌。同時，啶酰菌胺作用位點單一，病原菌基因組的單核苷酸突變就可能對其產生抗性，已被國際殺菌劑抗性委員會(FRAC)認定為產生抗性風險較高的殺菌劑，B.cinerea-啶酰菌胺也被FRAC認定為是具有高度抗性風險的病原菌-殺菌劑組合。中國、美國、德國等國家均已出現田間B.cinerea對啶酰菌胺產生抗性的報道，并伴隨防治效果下降。

因此，掌握和了解草莓灰霉病菌即B.cinerea對啶酰菌胺的抗性是提高防治草莓灰霉病菌效果的措施之一。但是目前，缺乏檢測草莓灰霉病菌是否對啶酰菌胺具有抗性的相關試劑。

鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測灰霉病菌對啶酰菌胺抗性的引物組，采用該引物組可以快速、有效地鑒別對啶酰菌胺有抗性的灰霉病菌，以及其對啶酰菌胺產生抗性的突變類型。

本發明的另一目的在于提供一種檢測灰霉病菌對啶酰菌胺抗性的試劑盒，采用該試劑盒可以快速、有效地鑒別對啶酰菌胺有抗性的灰霉病菌，以及其對啶酰菌胺產生抗性的突變類型。

本發明的另一目的在于提供一種檢測灰霉病菌對啶酰菌胺抗性的方法，采用該方法可以快速、有效地鑒別對啶酰菌胺有抗性的灰霉病菌，以及其對啶酰菌胺產生抗性的突變類型。

本發明是這樣實現的：

B.cinerea對啶酰菌胺的抗性產生主要與病原菌琥珀酸脫氫酶SdhB亞基發生點突變有關，最常見的突變位點為225位點(脯氨酸)與272位點(組氨酸)，包括P225L/F/T與H272Y/R/L等突變類型，P225F、H272R、H272Y等為常見的抗性突變類型。

AS-PCR(Allele-specific PCR)是目前檢測病原菌對殺菌劑抗性突變分子檢測中最常用的方法之一。AS-PCR的原理是通過特異位點處的PCR引物3’端與模板完全及不完全配對的擴增效率差異，確定該特異位點的突變情況。此方法具有簡單、快速、準確等優點。

基于此，本發明一方面提供了一種檢測灰霉病菌對啶酰菌胺抗性的引物組，其包括如下引物組合中的一種或多種：引物組合1、引物組合2和引物組合3；